微生物分离纯化实验——稀释涂布平板法
| 实验方法原理 | 该方法操作简便，普通用于微生物的分离与纯化。 其基本原理包括两方面： 1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、湿度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从面淘汰一些不需要的微生物。 2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | 肉膏蛋白胨琼脂培养基淀粉琼脂培养基（高氏 I 号）马丁氏琼脂培养基无菌玻璃涂棒试管无菌三角瓶玻璃珠无菌吸管接种环无菌培养皿显微镜记号笔 |
| 实验步骤 | 1. 倒平板 将肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 I 号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至 55～60℃ 时，高氏 I 号琼脂培养基中加入 10％ 酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液（终浓度为30 μg/ml），混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰i然后用右手手撑边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞（也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约 15 ml（图 VII-1），加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 2. 制备土壤稀释液 称取土样 10 g，放入盛 90 ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约 20 min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支 1 ml 无菌吸管从中吸取 1 ml 土壤悬液加入盛有 9 ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1 ml（无菌操作见图VII-2）加入另一盛有 9 ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀释度的土壤溶液，如图VII-3，A所示. 3. 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上 10-4、10-5 和 10-6 三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5 和 10-6 三管室温下静置 5～10 min，使菌液吸附进培养基。 平板涂布方法：将 0.1 ml 菌悬液小心地济在平板培养基表面中央位置（0.1 ml 的菌液要全部滴在培养基上，若吸移管尖端有剩余的，需将吸移管在培养基表面上轻轻地按一下便可）。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀玻璃涂棒（见图 VII-4），然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。 4. 培养 将高氏 I 号培养基平板和马丁氏培养基平板倒董于 28℃ 温室中培养 3～5 d，肉膏蛋白胨平板倒置于 37℃ 温室中培养 2～3 d。 5. 挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上（图 VII-3，C），分别置 28℃ 和 37℃ 温室培养，待菌苔长出后，检査其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检査是否为单一的微生物，若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。 |
| 注意事项 | 值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态待征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。 |
