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葡萄球菌属细菌的微生物学检验

2019.5.30

葡萄球菌属细菌的微生物学检验:一、生物学特性葡萄球菌是革兰阳性球菌,大小0.5~1.5μm ,呈单、双、四联、短链状或无规则葡萄状排列。无动力、无芽胞。其代谢方式是呼吸兼发酵。触酶阳性。通常氧化酶阴性,还原硝酸盐,能被溶葡萄球菌素溶菌,但不被溶菌酶溶菌。能利用多种碳水化合物,产酸。产生胞外酶,如葡萄球菌血浆凝固酶。多数菌为兼性厌氧菌,有氧条件下生长好,最适生长温度35 ℃~40 ℃,最适p H7.0~7.5 。金黄色葡萄

一、生物学特性

葡萄球菌是革兰阳性球菌,大小0.5~1.5μm ,呈单、双、四联、短链状或无规则葡萄状排列。无动力、无芽胞。其代谢方式是呼吸兼发酵。触酶阳性。通常氧化酶阴性,还原硝酸盐,能被溶葡萄球菌素溶菌,但不被溶菌酶溶菌。能利用多种碳水化合物,产酸。产生胞外酶,如葡萄球菌血浆凝固酶。多数菌为兼性厌氧菌,有氧条件下生长好,最适生长温度35 ℃~40 ℃,最适p H7.0~7.5 。金黄色葡萄球菌某些少见菌株,亦需要CO2 或血红素、维生素K等物质。葡萄球菌细胞壁缺陷型菌株适宜在高渗环境中生长。DNA 中G+C含量:30~39 mol%。模式菌:金黄色葡萄球菌。

二、微生物学检验

1.检验程序

2.标本采集

由于该属细菌对干燥和温度抵抗力强,且易从感染部位获取标本,故按常规方法采取标本。然而该属细菌广泛分布在人体皮肤和粘膜, 采取时避免病灶周围正常菌群污染。

3.标本直接检查

无菌体液如脑脊液和关节穿刺液可使用涂片、革兰染色、直接显微镜检查,查见细菌具有重要临床价值,其他体液标本如同时伴有炎性细胞时则直接显微镜检查结果也具有参考价值。涂片检查发现有革兰阳性球菌,则可向临床发生初步报告“查见类似葡萄球菌属革兰阳性球菌”,并进一步用培养法和合适的鉴定技术予以证实。

4.分离培养与药学招聘鉴定

临床标本可接种于血琼脂平板,那些有污染的标本如粪便等应接种在选择平板上,如甘露醇高盐平板、哥伦比亚多粘菌素奈啶酸平板,血液标本则用肉汤增菌培养基。孵育过夜平板上可见直径约为2~3 mm,呈金黄色、白色或柠檬色的光滑、不透明、凸起圆形菌落,有时可见β溶血环。挑取菌落作鉴定试验,在鉴定结果报告以前, 平板应继续室温放置2 ~3 天,观察菌落性状,有助于菌种鉴定。

细菌鉴定方法如下:

(1)菌落性状。血琼脂平板孵育24h 后,菌落直径1~3 mm ,培养物继续置室温生长,2 ~3 天后不同种葡萄球菌菌落性状如下所述:

a.金黄色葡萄球菌:较大,直径为6~8 mm,光滑、完整、稍隆起,半透明,金黄色色素或橙色。

b.表皮葡萄球菌:较小,直径为5~6 mm , 某些产粘液菌株能粘附在琼脂平板表面,无色素或白色色素。

c.溶血葡萄球菌:5~9 mm,光滑奶状,不透明,无色素或奶油色、黄色。

d.里昂葡萄球菌:4~7 mm,边缘整齐稍扁,奶色、黄色色素和沃氏葡萄球菌相似。

e.腐生葡萄球菌:5~8 mm 边缘整齐,光滑,不透明,凸起,白色或拧檬样色素。疑为葡萄球菌属细菌菌落以革兰染色证实为阳性球菌,以与酵母菌区别。

(2)凝固酶试验。是广泛应用于鉴定引起急性感染的病原性葡萄球菌的一种试验。有玻片法和试管法两种。该试验所使用的血浆为EDTA抗凝血浆。

a.玻片凝固酶试验:金黄色葡萄球菌表面有结合的凝固酶(聚集因子),与血浆中的纤维蛋白原交联使菌体快速凝聚。试验时挑取少数菌落培养物(不能用生长于高盐琼脂上的菌落) 加入一滴血浆,10秒内观察细菌聚集和凝块形成。金黄色葡萄球菌、中间型葡萄球菌呈现阳性反应。

b.试管凝固酶试验:细菌分泌到菌体外的凝固酶被血浆中的协同因子(cofactor)激活形成复合物,再使纤维蛋白原转变成纤维蛋白。试验时,以孵育过夜的牛心脑浸液肉汤培养物和血浆在37 ℃水浴中孵育4h,观察凝块形成。如试验结果为阴性者再置室温18~24h ,因某些菌种(中间葡萄球菌、猪葡萄球菌) 的凝集出现所需时间长4h 。但必须注意:

① 某些菌株产生的葡激酶在延长孵育时间后可使凝块溶解使之产生假阴性;

② 若使用不是无菌血浆可产生假阳性或假阴性结果;

③ 细菌不是纯培养物或污染可导致假阳性。

c.其他凝固酶试验:尚有商品化胶乳凝集试验和间接血凝试验检测凝固酶。胶乳凝集试验较一般的玻片法的特异性和敏感度高。

另外有一种新型的玻片试管法试验, 先将冻干的兔血浆置人反应管中, 
 

用前复溶,混人数个菌落,1 分数时悬液凝聚者为阳性,仍为悬液者为阴性。再将阴性反应管再经35 ℃温育5 小时,观察是否凝固以判断是否存在游离凝固酶。

(3)耐热核酸酶试验。大多数金黄色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌、猪葡萄球菌能产生耐热核酸酶。将待测菌的过夜肉汤培养物置沸水浴15min 后, 滴加于含甲苯胺蓝核酸琼脂上已打好的直径为2~5 mm 小孔内,置35 ℃ 孵育,1h 后观察结果,环绕孔周围蓝色琼脂转变为粉红为阳性。此外表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、肉葡萄球菌含微弱耐热核酸酶。

(4)磷酸酶试验。大多数的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌,该试验阳性。将待测菌种点种在加有硝基酚磷酸盐的p H5.6 ~6.8 M H 琼脂上,孵育18 ~24h ,菌落周围出现黄色为阳性。

(5)吡咯烷酮芳基酰胺酶试验。溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌和中间葡萄球菌为试验阳性。将孵育24 小时斜面培养物接种在含吡咯烷酮-β萘基酰胺(PY R) 肉汤中,使细菌浓度为2 号麦氏管浊度,35 ℃ 孵育2小时,加入PYR试剂后2分钟内呈现深紫红色为阳性。

(6)其他鉴定试验。鸟氨酸脱羧酶试验、脲酶试验、β-半乳糖苷酶、3-羟基丁酮酸试验、新生霉素敏感试验、多粘菌素B 耐药试验、糖产酸试验是常用的葡萄球菌属种间细菌的鉴定生化试验。临床上常见葡萄球菌菌种的鉴别见下表。商品化鉴定系统多应用糖发酵、传统的鉴定试验以及酶的产色底物试验,常用的有API 、Staph-ID 系统、APIstaph 系统,ID32staph 系统、uiten 革兰阳性鉴定卡、Microscan系统、Miniten 系统等。


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5.药物敏感性试验

葡萄球菌属细菌药敏试验选择抗生素:A 组(常规首选药物) 为苯唑西林青霉素;组(临床使用主要药物) 阿齐霉素、克林霉素、甲氨苄啶/磺胺甲口恶唑、万古霉素;C 组(对A 组耐受、过敏或无反应者) 选用环丙沙星庆大霉素氯霉素;U 组(尿道中分离的细菌) 用诺氟沙星呋喃妥因

通过药敏试验可筛选出耐甲氧西林葡萄球菌(methecillin resistant Staphylococcus ,M RS),它是携带mecA 基因、编码低亲和力青霉索结合蛋白导致耐甲氧西林、所有头孢菌素、碳青霉烯类、青霉素类+青霉素酶抑制剂抗生素的葡萄球菌,该菌是医院内感染的重要病原菌,感染多发生于免疫缺陷患者、老弱患者及手术、烧伤后的患者、极易导致感染暴发流行,治疗困难、病死率高。

6.其他

尚可用ELISA 或对流免疫电泳方法检测金黄色葡萄球菌磷壁酸抗体;用脉冲凝胶电泳法对葡萄球菌的质粒和染色体进行限制性内切酶图谱分析等非培养方法的检测。

7.检验结果分析与医学全在线报告

葡萄球菌是临床上常见的细菌, 经涂片染色镜检观察革兰阳性球菌和典型菌落形态,若触酶试验阳性者,应先用凝固酶试验检查,将其分成凝固酶阳性和凝固酶阴性细菌。前者大多为金黄色葡萄球菌,应及时快速鉴定和进行药敏试验,尽快报告临床。后者大多是从输液导管、人工植入组织中分离出的细菌,应视为病原菌,须鉴定到菌种。对凝固酶阴性葡萄球菌,可先用呋喃唑酮纸片(100μg/片),杆菌肽纸片0.04u/片作药敏试验和氧化酶试验,以此与微球菌属细菌鉴别,微球菌对杆菌肽敏感而对呋喃唑酮耐药、氧化酶试验阳性,与葡萄球菌属正好相反。若药物敏感性试验是用氧西林耐药的菌株,则报告该菌株耐所有青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和β-内酰胺药β- 内酰胺酶抑制剂类抗生素,同时对氨基糖苷类,大环内酯类和四环素类抗生素也耐药。

三、临床意义

凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌是人类重要致病菌,可引起社区和医院感染。感染常以急性、化脓性为特征,如果未经治疗,感染可扩散至周围组织或经菌血症转移至其他器官。常见的感染有、外科切口、创伤等局部化脓性感染和骨髓炎、化脓性关节炎肺炎、心内膜炎、脑膜炎等全身性感染。金黄色葡萄球菌的致病性主要与各种侵袭性酶类(如血浆凝固酶、透明质酸酶、磷脂酶、触酶、耐热核酸酶)
 

和多种毒素(溶血毒素、杀白细胞素等) 有关。某些菌株产生的肠毒素可引起食物中毒,表现为急性胃肠炎。噬菌体Ⅱ组金黄色葡萄球菌产生的剥脱毒素(或称表皮溶解素) 可引起人类烫伤样皮肤综合征,多见于新生儿、幼儿和免疫功能低下的成人。患者皮肤呈弥漫行红癍和水疱形成,继以表皮上层大量脱落。由噬菌体Ⅱ型金黄色葡萄球菌产生的毒性休克综合征毒素-1(toxic chock syndrome toxin1,TSST-1), 引起机体发热并增加对内毒素的敏感性,该毒素属超抗原家族,刺激T 细胞诱发TN F 和LI-1,可致机体多个器官系统的功能紊乱或引起毒性休克综合征(TSS)。

凝固酶阴性葡萄球菌是人体皮肤粘膜正常菌群之一,是医院感染的主要病原菌,其中表皮葡萄球菌引起人工瓣膜性心内膜炎、静脉导管感染、腹膜透析性腹膜炎、血管移植物感染和人工关节感染等;腐生葡萄球菌则是女性尿路感染的重要病原菌,其他凝固酶阴性葡萄球菌也已成为重要的条件致病菌和免疫受损患者的感染菌。感染的发生常和细菌产生夹膜多糖或糖萼有关,它增强细菌与药学招聘外来物质(生物性瓣膜、导管等) 表面的粘附或在其表面形成一层生物膜而保护细菌对抗杀菌物质作用。葡萄球菌的耐药性已演变为医院感染和临床治疗的棘手问题。



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