PCR实验中DNA聚合酶的选择及实验方法
一、 DNA聚合酶的选择
实验室常用 DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和 PyrobestTMDNA Polymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA 聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有 Proof reading活性的耐热性 DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物 3’端附有一个 “A ”碱基，如果希望直接将产物克隆 到 T -vector可以用此酶。
PyrobestTMDNA Polymerase 也是具有Proof reading 活性的耐热性DNA 聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的 PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增 请使用此酶。
二、按下列组成在PCR 反应管中调制反应液
TaKaRaTaqTM或TaKaRaE XTaqTM的配方
| Reagent | Quantity,for 50µ l of reactionmixture |
|---|---|
| 10X PCR buffer （Mg2+free） | 5 µl |
| MgCl2（25mM） | 如 TaKaRaTaqTM加 3 µl |
| 如 TaKaRaEXTaqTM加 4 µl | |
| 2.5mMdNTP mix | 4 µl |
| 10µ M Primer 上游 | 1 µl |
| 10µ M Primer 下游 | 1 µl |
| TemplateDNA | 1 µl |
| Taq或E XTaqDNAPolymerase | 0.25 µl |
| Steriledeionizedwater | Up to 50µl |
| Total | 50 µ l /Sample |
PyrobestTMDNA Polymerase的配方
| Reagent | Quantity,for 50µ l of reactionmixture |
|---|---|
| 10X Pyrobestbuffer | 5µl |
| 2.5mMdNTP mix | 4µl |
| 10µ M Primer 上游 | 1µl |
| 10µ M Primer 下游 | 1µl |
| TemplateDNA | 1µl |
| PyrobestTMDNA Polymerase | 0.25µl |
| Steriledeionizedwater | Up to 50µ l |
| Total | 50µ l /Sample |
①反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 20~50µ l以节约试剂；
②将上表各成分加入到 0.2ml或 0.5ml灭菌的 PCR薄壁管中；
如果不用 PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 ~ 50µ l的矿物油 防止样品在 PCR的过程中蒸发；
三、按以下程序进行PCR 扩增
PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR结果而进行优化。
| Step | Temperature,° C | Time,min | Number of cycles | Note |
|---|---|---|---|---|
| 起始变性 | 94~95 | 1~3 | 1 | |
| 变性 | 94~95 | 0.5~2 | 25~35 | 退火温度比理论退火温度大概低 5°C，再根据反应结果优化 |
| 退火 | 37-70 | 0.5~2 | ||
| 延伸 | 70-75 | 根据扩增产物的大小 | 每分钟延伸 1000bp | |
| 最终延伸 | 70-75 | 10 | 1 |
反应结束后，抽取扩增样品 5µ l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用
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