兴奋剂检测的有效萃取方法

为了检测赛骑体液中的药物活性物质，根据基体的复杂程度采用合适的样品预处理方法是正确检测的关键，本文介绍的分散固相萃取法（DPX）不失为一种有效的方法。

“兴奋剂”是体育运动赛事里备受关注的检测项目，但是除了常规的运动员检测外，诸如马、骆驼等赛骑动物，也有可能会使用兴奋剂，以达到越过传统训练，暂时提高动物运动能力的非法目的。公众赛马化学家协会（AORC）是一个抵制动物兴奋剂行为的组织结构，该协会举办了多场专业研讨会，旨在交流有关兴奋剂方面活性物质及其检测方法的最新进展。本年度，兴奋剂的分析专家们相聚于新加坡的一个“赛马俱乐部”，在那里，Gerstel成功地展示了基于分散式移液管固相萃取（DPX）的全自动GC-MS方法，用于检测马尿基体中提高效能的物质（如咖啡因）以及降低运动效能的物质（如地西泮），并通过现场检测，对方法的实用性进行了验证。

复杂基体充满挑战

检验过程充满了挑战，Gerstel公司的应用专家Oliver Lerch博士说：“马尿相对偏酸性，食草性动物如马、骆驼的尿液中，含有一系列酚类化合物，使得检测样品中的药物活性物质存在困难。”如果要采用气相色谱-质谱检测法，首先必须有一种适当的萃取方法，将干扰性的基体进行安全和可靠地分离，同时富集将待分析溶质。AORC期待有一种快速的自动化方法，于是这种分散式移液管固相萃取技术（DPX）便成为了应用专家们关注的焦点。DPX技术可以看做是一种固相萃取技术（SPE），但不同于经典的固相萃取，它呈现自由的状态位于移液管的尖端，而非置于装填的柱子中，这种设计使液体样品之间的物质交换速度加快了数倍，同时也使所需要的样品量显著减少。该技术还提供了自由选择吸附剂、选择分析流程包括样品预处理、选择色谱和检测的自动化的可能性，令专家们更加充满期待。

图2.  为后续的DPX萃取进行取样。

吸附剂的选择

Oliver Lerch博士试验了不同类型的吸附剂，最后决定采用WAX材料（弱阴离子交换树脂，混合型），基于如下考虑：存在于马尿中的酚类，在碱性介质中部分去质子化而与阴离子交换树脂相结合，而不带电荷的分析溶质结合于吸附剂的“骨架”上，可采用有机溶剂洗脱下来，酚类则留在吸附剂上，从而将大部分无用物分离除去。样品预处理最后可归结为：1.2ml尿液与120μlNaOH混合，摇匀，以6000r/min离心分离10min，取上清液1.1ml，相应于1ml尿液，与DPX进行混合。

其后的样品处理在Gerstel多用性进样器（MPS）上通过计算机控制，以全自动化的方式进行，其间按时接入GC-MS分析。按照程序，MPS以500μl甲醇对吸附剂材料进行条件化，继以2ml水冲洗，然后吸入样品，共计3次，通过吸入空气使样品与吸附剂混合，每次混合后将余留的样品从移液管尖端排除弃掉，在用2ml水重新洗涤吸附剂后，将分析溶质用500μl丙酮解吸。

图3.  DPX萃取技术示意图。

自动化技术提高效率

“尽管采取了相关措施对分析溶质进行富集和萃取，然而马尿样品含有一定量的污染性基体组分，可能对分析过程和仪器带来负面影响，尤其是为了提高敏感度而采用例如8?μl这样的大体积注射方法（LVI）。”Oliver Lerch博士说。因此在应用气相色谱（安捷伦7890 GC）时，必须对用于样品注射的程序温控蒸发器（PTV）导入口的内衬部件（Gerstel 冷进样系统KAS）按照一定的时间间隔更换，而采用手动更换则十分繁琐费事。Gerstel多用性进样器提供“ 自动化的内衬更换技术（ALEX）”,可以方便有效地自动实现这一更换操作。“这就意味着无须实验人员监控，即可在夜间和周末对大批量样品进行分析。”Oliver Lerch博士说。

为了洗脱高沸点的溶质，并持续地保证柱子的稳定性和保留时间的重现性，Oliver Lerch博士用了两种柱子（两者皆为15m HP-5ms UI 0.25mm，0.25μm），采用中部柱反洗法。“这种方法能做到将污染性的基体部分于规定时间向原注射的方向反冲出来”。检测在安捷伦7000三重四极质谱仪上完成，每一溶质均采用MS/MS加以记录。

图4.  DPX-LVI-GC/QQQ-MS系统测得的兴奋剂色谱图。

小结

科学家们用一系列在赛马运动中经常使用的兴奋剂对方法进行了验证，证明了这种DPX-LVI-GC/QQQ-MS系统（分散式移液管固相萃取-大体积进样-气相色谱法/三重四极质谱法）在兴奋剂监控领域的适用性，这些化合物有利多卡因、克伦特罗、丙嗪、苯甲二氮卓、睾丸素、咖啡因、宝丹酮以及泼尼松龙等。

方法显示了具有宽广范围的线性，相关系数范围0.9971~0.9998，回收率大于90%，相对标准偏差（RSD）小于6%。Oliver Lerch博士将新加坡公众赛马化学家协会（AORC）用户反应归结为一点，那就是“这种方法实现了方便的自动化，为分析检测带来了高效率”。

复杂基体的萃取

样品的基体越是复杂，合适的萃取技术就显得越加重要。方法必须保护分析仪器不受有害物质的损害，并安全分离干扰性的基体组分，以及对分析溶质进行必要的富集。这种DPX萃取技术（分散式移液管萃取）正合此用，它加速了与样品的物质交换，此外较之经典的萃取技术，仅需要较少的溶剂。