基于动力学校准大鼠脑组织中内源性神经酰胺定量iMSI
再帕尔•阿不力孜科研团队 第65期
中国医学科学院药物研究所
天然药物活性物质与功能国家重点实验室
文献整理：金波 指导教师：贺玖明
美国伊利诺伊大学香槟分校的Jonathan V. Sweedler团队在《Analytical Chemistry》上发表了一篇题为“Quantitative Imprint Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Ceramides in Rat Brain Tissue with Kinetic Calibration”研究论文，基于标准品与分析物吸附与解吸之间的动力学特性，采用预加载标准品的二氧化钛-多巴胺（TiO2-DA）整体层，对组织切片印迹进行定量质谱成像。
背景介绍
许多MSI研究已从分析物鉴定转移到比较大脑区域之间的分析物水平。由于组织的组成不同，即使在大脑的邻近区域，也需要能够解决化学异质性的方法。目前已有不同的样品制备技术，目的是在样品表面获得确切的标准品浓度，从而进行定量分析。但是，内源性分析物与在组织中的加标标准品之间的传质速率差异使得难以对化学性质和结构复杂的生物样品进行定量。
实验设计
1 印迹质谱成像（iMSI）流程（图1）：
（A）TiO2-DA整体涂层的制备：在乙醇水溶液中使用正丁醇钛（IV）水解制备TiO2纳米颗粒溶液（溶液I）；将250μL溶液I在含有0.005 M多巴胺盐酸盐的5 mL 5％水-乙醇溶液中稀释，然后孵育1 h（溶液II）。与目标距离保持50cm左右，使用喷枪在ITO载玻片上持续喷涂溶液II 5分钟，使TiO2-DA层的最终密度为〜400μg/cm2。将包含10μg/mL标准品溶液的0.5μL小滴阵列点样至TiO2-DA整体层上。（B）将脑组织切片压印在TiO2-DA整体层上并喷涂ACN润湿使发生吸附和解吸。（C）冲洗整个样品来去除组织切片，然后在〜25°C的N2室中干燥TiO2-DA整体涂覆的ITO玻璃载玻片。进行激光解吸电离质谱成像（LDI-MSI）分析。
图1使用TiO2-DA整体层和动力学校准的定量iMSI的样品制备和分析过程的示意图
2 直接的组织表面辅助激光解吸电离质谱成像（SALDI-MSI）：
将脑组织切片置于ITO载玻片上。使用喷枪施加溶液II，并在环境条件下快速干燥。将包含10μg/mL标准品溶液的0.5μL小滴阵列点样至TiO2-DA整体层上。使用喷枪喷涂ACN。为了比较不同样品制备条件下的校准结果，改变溶液II和ACN的气压和喷涂时间以提供湿润或干燥的条件。进行LDI-MSI分析。
3 LDI-MSI分析条件：
TiO2-DA整体层辅助LDI飞行时间（TOF）/ TOF MSI（适用于SALDI和iMSI）均使用UltrafleXtreme II质谱仪（Bruker），配备固态UV Smartbeam II激光器。MS质谱图的m/z范围为20-3000。DHB、缓激肽和血管紧张素II的混合物沉积在脑组织区域附近，用于质谱重新校准。
结果与讨论
1基于TiO2-DA辅助的iMSI
iMSI能够检测磷脂和其他Lewis碱性脂质。iMSI简化了分析物的环境，因此降低了基质的影响，并提高了目标分析物的灵敏度。但其重现性和定量性能尚待确定，因为将分析物从生物组织转移至成像的表面取决于生物组织的性质。为了解决这些差异，在iMSI的基础上采用动力学校准方法。
对比SALDI MSI和iMSI结果，两种方法均能观察到相同的主峰，但峰的相对强度不同（图2）。在700-900 Da的质量范围内，PC和PE信号在iMSI中产生了更高的相对峰强度。而在200-700Da的质量范围内，iMSI的大多数峰强度比SALDI-MSI低5-10倍。m/z 200-700范围内的大多数峰代表脂肪酸（m/z 200-400）、胆固醇（m/z 400-500）、神经酰胺和二酰基甘油（m/z 500-700）。观察到的峰强度差异的可能解释为TiO2-DA材料与常见的Lewis碱（例如脂肪酸的羧基、胆固醇的羟基和神经酰胺的氨基）的亲和力较低。因此，在与磷脂的竞争结合下，小分子（如脂肪酸）的吸附效率会降低。此外，尽管iMSI中使用了多步骤样品处理方法，但检测到的化合物的空间分布与SALDI MSI所观察到的结果相似。例如，两种方法产生的神经酰胺和PE离子的空间分布相似（图2）。此外，iMSI在分子图像中产生了更好的对比度，这表明在iMSI样品制备过程中化合物的定位得以保留。
图2 右侧的离子图像中由黄色圆圈勾勒出的大脑区域的代表性质谱图，其中（A-1，B-1）iMSI和（A-2，B-2）直接组织SALDI MSI，其中A为较高 m/z范围（A，m/z 200-700），B为较低m/z范围（B，m/z 700-900）。右侧的离子图像分别为（A）m/z 838.5和（B）m/z 588.5离子的信号分布。这些测量中使用同一小鼠大脑的相邻部分。
2 比较基质效应对iMSI和SALDI MSI结果的影响
通过测量微点阵列包含的脂质标准物质的信号比率以确定基质效应，两组分别为（1）SALDI-MSI：组织切片对比干净的ITO玻璃表面（2）iMSI：组织印迹对比干净的载有TiO2-DA整体层的ITO玻璃表面。结果如表1所示，iMSI对神经酰胺的Na和K加合物显示出5％至90％的基质效应。相反，SALDI-MSI对神经酰胺峰的Na加合物表现出最低的基质效应（11％），而对K加合物信号表现出最高的基质效应（1330％）。说明组织、组织印迹和空白区域在化学复杂性方面的差异（包括无机盐成分及其含量），均影响基质效应。对于PE，iMSI方法的基质效应通常低于20％，并且在不同的大脑区域结果均相似（表1）。相反，在SALDI MSI测量中观察到的基质效应在不同大脑区域之间具有很大的变异性，从而影响了PE的最终分子图像。基质对脑苷脂信号的作用类似于对PE信号的作用。
上述结果表明，iMSI总体上表现出较低的基质效应，而且由于降低了由基质效应引起的脑区域依赖性的变化，化学成像分析的质量和准确性得以提高。
表1基质对不同脑区中不同脂质标准品的直接组织SALDI MSI和iMSI检测结果的影响
a CTX，皮质；CC，胼胝体；CA1，海马体I区；CA3，海马体III区；Cer，神经酰胺； PE，磷脂酰乙醇胺；CB，脑苷脂。评估所有点/像素的均值±标准差。通过测量沉积在ITO玻璃上的微点阵列所确定的脂质标准信号区域比率来确定基质效应百分比（1）组织切片和干净的ITO玻璃表面（SALDI MSI）（n = 2动物）和（2）组织印迹和干净的载有TiO2-DA整体层的ITO玻璃表面（iMSI）（n = 2只动物）
3 iMSI定量分析中的动力学校准和测量变异性补偿
注：由于公式格式显示错误，故采用图片格式展示上一段内容。
为了开发使用动力学校准的定量iMSI方法，选择了神经酰胺（Cer d18:1/18:0）作为目标分析物。它以相对较低的浓度存在于脑组织中，可以用TiO2-DA辅助LDI进行检测。将Cer d18:1/6:0作为标准品，虽然它在鼠脑组织中不存在，但它具有与内源性Cer d18相似的检测性能。控制动力学研究的吸附/解吸时间，以及使用喷枪系统通过恒定流速喷涂不同体积的溶剂（ACN）来改变溶剂施加时间。iMSI测量结果表明，内源性Cer d18:1/18:0的吸附曲线与标准Cer d18:1/6:0的解吸曲线对称（图3）。但是，更长的分析物提取时间（当ACN施加时间超过5min时）导致n / ne和Q / q0之和增加。此外，K×A×S / Vs可以使用标准品的解吸曲线来计算。对于标准品Cer d18:1/6:0，K×A×S / Vs的值为1.32。
图3 TiO2-DA整体层吸附内源性神经酰胺（Cer d18:1/18:0）的各向同性和TiO2-DA整体层解吸的神经酰胺标准品（Cer d18:1/6:0）与应用的ACN溶剂量的关系。使用喷枪以恒定的喷雾流速（〜1 mL/min）在不同时间（1、3、5、7和15分钟）将ACN施加到样品上。喷雾覆盖的样品面积大于脑组织占据的面积。吸附和解吸的实验时间随ACN体积的增加而增加。显示了平均值和标准偏差。
4 动力学校准和加标校准的比较
ITO载玻片的ACN喷雾覆盖区域比组织所占据的表面大得多，因此喷雾在组织上的液滴尺寸相对均匀。为了控制液滴的大小，调节雾化气体（N2）的压力以控制喷枪喷嘴处的雾化气体与溶剂的比率。结果，所施加的溶剂液滴尺寸和溶剂施加时间的差异导致了干燥或湿润的分析物提取条件。干燥条件：使用较高的气压，并减少溶剂的喷雾时间。湿润条件：使用较低的气压和较长的溶剂喷射时间。
基于标准添加校准方法的SALDI MSI，在湿润条件下得到的值更大（图4A）。与神经酰胺标准品相比，内源性神经酰胺信号强度在这些条件下具有不同的传质动力学，从中可以得出选择正确的内标非常重要。
iMSI法在湿润和干燥条件下的绝对浓度比在0.66和4.24之间（图4B），而标准添加校准方法的湿干条件定量比在3.04-34.3之间（图4A）。尽管这两种方法都不理想，但图4显示，即使在极端干燥和湿润的样品制备条件下，动力学校准也可以实现更均匀的定量。该结果表明，TiO2-DA整体层中标准品的解吸量的变化可用于补偿在不同条件下内源性神经酰胺的吸附量的变化。
图4 使用（A）标准添加校准和（B）动力学校准在不同样品制备条件下相同组织的MSI定量结果。所比较的大脑区域编号为1-6：海马（1），皮质/纤维束（2），丘脑（3），尾鳍足/纤维束（4），下丘脑（5）和皮质亚板（6）。显示了在干燥条件和湿润条件下具有标准偏差的平均值以及平均定量结果的比率（r）。
5 LC-MS/MS方法验证
iMSI方法与“金标准”LC-MS/MS法定量结果的相关系数为0.9。如图5所示，除了鼠2和鼠3的区域1的iMSI定量结果高于LC-MS/MS，其他区域的iMSI定量结果与LC-MS/MS法相似。iMSI结果相对于LC-MS/MS结果的相对回收率为72-200％, 而标准添加校准法的相对回收率为200-5000%。
关于鼠2和鼠3的区域1在两种方法之间的差异性值得讨论。该区域是大脑中更具空间异质性的区域之一，包含了海马的CA1和齿状回细胞层。因此，可能是组织打孔和ROI采集的细微差异导致了问题。此外，当干燥ITO载玻片上的组织切片时，经常观察到组织中出现裂缝，这些裂缝将这些大脑区域与皮质分开。因此，用高空间分辨率的MSI和良好的样品制备方法可以减轻影响。
总体而言，MSI和LC-MS/MS之间的定量结果具有可比性，其中LC-MS/MS法的精度更高。
图5 基于动力学校准的iMSI与基于外标校准的LC-MS /MS结果的比较。直方图说明了从六个感兴趣区域（插图中的红色圆圈；采集的区域为海马体）采集的样品，红色条为iMSI定量结果，黑色条为LC-MS/MS定量结果。（1）皮层/纤维束（2），丘脑（3），尾鳍足/纤维束（4），下丘脑（5）和皮质亚板（6）。RR表示iMSI结果的相对回收率或准确度，其计算方法是将iMSI定量结果除以LC-MS /MS结果。插图：三只不同大鼠的大脑组织切片中Cer d18:1/18:0信号图像。显示了平均值和标准偏差。
结论
在本研究中，具有预加载标准品的TiO2-DA整体层和具有动力学校准的印迹法使MSI具有可靠的半定量结果。具有Lewis碱性性质的分子（例如磷脂、神经酰胺和胆固醇）可从脑组织中解吸出来，而不会出现明显的空间离域现象。使用印迹法可使基质效应降低，从而使测量结果可重复且在不同组织之间变化较小。利用动力学校准的定量iMSI可以补偿内源性分析物在局部传质方面的差异。使用动力学校准的iMSI和 LC-MS/MS进行比较，两种不同的方法产生了相似的定量结果（相关系数> 0.9，结果之间的比率0.72-2.0）。
缩略语
TiO2-DA：titanium dioxide-dopamine，二氧化钛-多巴胺；iMSI：imprint mass spectrometry imaging，印迹质谱成像；ITO：Indium tin oxide，铟锡氧化物；LDI-MSI：laser desorption ionization mass spectrometry imaging，激光解吸电离质谱成像；SALDI：surface-assisted laser desorption ionization，表面辅助激光解吸电离；DHB：2,5-dihydroxybenzoic acid，2,5-二羟基苯甲酸；ACN：acetonitrile，乙腈；PC：phosphatidylcholin，磷脂酰胆碱；PE：phosphatidylethanolamines，磷脂酰乙醇胺；Cer：ceramide，神经酰胺；
LC-MS/MS：liquid chromatography tandem mass spectrometry，液相-串联质谱联用；CA1：region I of hippocampus proper，海马体I区；CTX：cortex，大脑皮层；CC, corpus callosum，胼胝体；CB, cerebroside，脑苷脂
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焦点事件
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标准
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企业风采
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精英视角
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