使用超高效合相色谱(UPC2)分析人体尿液中的三环...（一）

使用超高效合相色谱(UPC²)分析人体尿液中的三环类抗抑郁药

应用优势

Xevo® TQ-S质谱仪

关键词

合相色谱，Oasis，样品制备，生物分析，三环类抗抑郁药，定量，UPC²

简介

三环类抗抑郁药(TCA)是较老的一类药物，但仍具有药理学作用。例如，对其它类抗抑郁药反应较差的药物受试者仍较常见，由此决定了TCA仍具有持续的生存空间。此外，这类药物比其它新型的抗抑郁药要便宜得多，因此在门诊中也有使用。过去，人们使用GC、 UV、 或LC/MS对TCA进行分析。UPC²™技术可对有机提取物进行分析，因此在生物分析测定领域备受青睐。有机提取物可通过此领域中最常见的样品制备方法，例如蛋白质沉淀(PPT)、液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)法获得。反相色谱系统在进样前需对有机提取物进行蒸发和复溶，而非水溶剂系统则不需要此环节。UPC²技术具有主要溶剂(CO₂)环保、可再生、可与反相色谱进行正交实验、以及可利用多种固定相的特点，使其具备了低溶剂消耗和低成本的优势，从而增加了生物分析方法开发的选择性和灵活性。因此，本实验以人体尿液中TCA的分析为例，进行了一项确证UPC²分离适用性的论证性研究。研究中所用特定TCA的结构见图1。虽然人们对GC和LC方法开发途径有很好的定义并在常规应用中使用，但UPC²分离的方法开发仍是一块较新的研究领域。本应用纪要中重点描述了某些关键的UPC²参数并提供了适用的筛选选项。例如，色谱柱化学性质、pH和进样溶剂由色谱柱管理器和四元溶剂切换系统进行系统化的自动筛选。在选择色谱柱、流动相和进样溶剂后，系统将使用通过筛选试验获得的最佳条件对梯度进行优化并分析尿样提取物。在尿液检测中，各抗抑郁药的定量下限(LLOQ)0.1 ng/mL可轻松达到，符合FDA针对生物分析方法制定的LLOQ测定标准。另外，简化的标准曲线（无内标物）在+/-1%至8%范围内的线性和准确度良好。

实验

UPC²条件

系统： ACQUITY UPC²
色谱柱： ACQUITY UPC² BEH
2.1×50 mm，1.7 µm
流动相A： CO₂
流动相B： 含0.2% NH4OH的甲醇
清洗溶剂： 60:40的乙腈/ 异丙醇+2%甲酸
分离模式： 流动相B在2 min内从2.0%增加至40%；达到30%时保持1 min。
流速： 1.4 mL/min
CCM反压： 1750 psi
柱温： 40 ℃
样品温度： 10 ℃
进样体积： 2.0 µL
运行时间： 3.0 min
补液流速： 0.25 mL/min含0.2% NH4OH的异丙醇
收集板： 沃特世（Waters®） 1 mL ACQUITY®收集板

MS条件

质谱仪： Xevo TQ-S
电离模式： ESI+
毛细管电压： 1.0 kV
碰撞能量： 按组分优化（见表格1）
锥孔电压： 按组分优化 （见表格1）

数据管理

色谱软件：MassLynx®
定量软件：TargetLynx™
优化软件：IntelliStart™

图1. 三环类抗抑郁药分析物的结构式。

实验

样品描述

采用Oasis WCX 96孔 µElution板制备尿样。首先，在200 µL样品中加入200 µL的4% H₃PO₄溶液，混匀；先用200 µL甲醇平衡萃取板中的各孔，然后用200 µL水平衡；将样品稀释液(400 µL)加载到板上；依次用200 µL 10 mM醋酸铵溶液(pH 6)、200 µL甲醇淋洗；用含2%甲酸的ACN/MeOH(60:40)溶液洗脱TCA，每次25 µL，洗脱2次，合并洗脱液。取洗脱液2 µL直接注入ACQUITY UPC²系统。

储备溶液和工作溶液均以甲醇为溶剂。向2 mL尿液中加入20 µL复合工作溶液（各化合物浓度为1 µg/mL）制成含5种抗抑郁药的尿样，此方法制成的尿样浓度为10 ng/mL。其它浓度的样品溶液通过使用对照人体尿液连续稀释高浓度的标准溶液制备而得。在本论证性研究中，制备并用于萃取的尿样最终浓度分别为：0.1、0.2、0.5、1.0、5.0和10.0 ng/mL。为确定定量下限(LLOQ)，实验还对空白尿进行了萃取。

表1. 4种抗抑郁药物组的MS条件。

• 环保、可持续（绿色）化学

• 分析速度快

• 定量准确

• 可与反相色谱进行正交实验

• 可使用SPE洗脱液直接进样

  沃特世解决方案

• ACQUITY UPC²™系统

• ACQUITY UPC²色谱柱

• Oasis®  WCX 96孔µElution板（部件号186002499）

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