ECL Plus超敏发光液的使用

　　ECL Plus超敏发光液的使用

　　1.常规电泳、跨膜、HRP标记抗体或核酸探针培养和膜清洗。应注意用HRP或夹心法标记免疫球蛋白，或用抗链霉素生物素HRP夹心法标记免疫球蛋白。将核酸杂交膜与HRP标记探针杂交并清洗。

　　2.在清洗膜上用HRP标记第二抗体的同时，新鲜制备工作液：将相同体积的A和B分别混合，置于室温下，恢复荧光强度，否则荧光强度会减弱。建议立即使用工作液。它在室温下几小时后仍可以使用，但灵敏度略有降低。

　　3.用镊子把膜取出，放在滤纸上，把乳液排出，但不要使膜完全干燥。将薄膜完全浸入并与发光工作液（约0.125 ml发光工作液/cm2薄膜）完全接触。在室温下孵育3分钟后，立即将薄膜压平并曝光。长孵育时间不会增加敏感性，有时会导致异常暴露带。发光过程的本质是酶促反应。发光工作液太少不利于反应，也会导致薄膜上条带曝光不均匀，灵敏度大大降低。为了省钱，可以减少薄膜的用量，但不应减少发光液的用量。

　　4.用镊子拿起薄膜，放在滤纸上，放出发光工作液。但不要把光亮冲走。

　　5.将面积大于胶片的保鲜膜放在X射线胶片盒内部。混合膜贴在保鲜膜上。混合胶卷被折叠起来并完全包裹起来。去除气泡和皱纹，并可切断边缘多余的保鲜膜。用滤纸吸收多余的荧光工作液。将覆盖混合膜的保鲜膜用胶带固定在暗盒中，推荐的蛋白带朝上。

　　6.把X光胶片放在黑暗中，曝光时间不同，比如几秒到几分钟。冲洗显影液。

　　ECL Plus超灵敏发光溶液注意事项：

　　1.步骤1-5可以在荧光灯下操作，但在强光照射时间过长时，发光液体的灵敏度可能会略有降低，因此可以避免移动到暗室。戴手套可以避免在膜上留下指纹，保持膜的清洁。

　　2..长期暴露或蛋白质过量会加深背景，使带强度变化失去线性关系。曝光不足会使波段变模糊。

　　3.膜上的带在孵育3分钟后会发光。暗室中肉眼可见强条带，而低丰度蛋白条带则较弱。虽然肉眼看不见，但它们可以曝光X光片。光波段的发光时间不能单独用肉眼观察来判断。不可见荧光实际上持续数小时，使X射线胶片感光，因此弱带可以暴露1-10小时。如果暴露后条带不好，可使用洗涤缓冲液清洗膜，再次出现第二抗体，然后重新使用ECL灯和暴露。

　　4、由于超敏发光液的高灵敏度，强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗 1：1000-1：4000，二抗 1： 2000-1：5000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带，导致失败！

　　5.一些商业保鲜膜封装的压印膜将熄灭荧光。选用优质保鲜膜，如“克林来”牌保鲜膜。

　　6.使用可见的预染色蛋白标记和荧光放射自显影曝光标签可以帮助确定胶片上条带的确切位置和尺寸。

　　7.NaN3能抑制HRP的活性。第二种抗体回收后应避免使用NaN3。如有必要，不得超过0.01%。

　　文章链接：仪器设备网 https://www.instrumentsinfo.com/technology/show-953.html