褪黑激素ELISA试剂盒使用说明（二）
8.2样品的稀释
如果怀疑样品中的褪黑激素浓度比最高标准品的高，必须将样品在提取步骤前用检测缓冲液进行进一步的稀释。
8.3样品、标准品和质控品的提取（提取柱）
按照此步骤进行提取，提取量大约为90-100%。
为了避免柱子堵塞，提取样品前将样品过滤或离心一下。
注意 | 每份样品、标准品和质控品都必须提取，提取必须提前进行。干燥的提取物（甲醇蒸发后）可在2-8℃或-20℃下储存24个小时。 用甲醇洗提后，提取柱就可以用于下一份样品的提取或是存放到2-8℃的环境下。提取柱可以反复使用4次。如果是重复使用，在再次从A.1开始（柱的调制）。 |
A、标准版本：离心与蒸发离心步骤
1.柱的调制
1 | 将提取柱放到聚苯乙烯或玻璃试管中（12×75mm）。 |
2 | 在提取柱中加入2×1ml的甲醇(未稀释的)，200g离心1min使溶剂通过提取柱，弃取洗出液。 |
3 | 向提取柱中加入2×1ml的蒸馏水，200g离心1min使溶剂通过提取柱，弃取洗出液。 |
4 | 为了避免柱子变干，请立即提取样品。 |
2.样品提取
5 | 将提取柱放到相应的标记聚苯乙烯或玻璃试管中（12×75mm）。 |
6 | 向提取柱中加入0.5ml标准品、质控品和样品，200g离心1min使溶剂通过提取柱，弃取洗出液。 |
3、洗涤
7 | 向提取柱中加入2×1ml的10%甲醇（蒸馏水稀释），500g离心1min使溶剂通过提取柱，弃取洗出液。 |
4、提取物的洗脱
8 | 将提取柱放到新的标记聚苯乙烯或玻璃试管中（12×75mm） |
9 | 向提取柱中加入1ml未稀释的甲醇，200g离心1min使溶剂通过提取柱。 |
10 | 将提取柱从试管中移出，避免液滴还停留在柱子中。将柱子用于下一份样品的提取或存放于2-8℃的环境下。提取柱可重复使用四次。 |
5.提取物的蒸发和重新配置
11 | 用蒸发离心机将甲醇蒸发掉。 |
12 | 用0.15ml的蒸馏水重新稀释配置样品 |
13 | 旋涡混和1分钟，并立即检测样品。 |
B、选择性版本：用多头抽真空装置代替离心机
提取步骤仍然按照A1-5进行，柱子不变。 用真空和≤5ml/min的流速使溶剂通过柱子。 样品和提取物用≤2ml/min的流速。 用蒸发离心机或氮气蒸发干燥溶剂。 |
9、实验步骤
1 | 将提取好的标准品、质控品和样品分别50ul加入到相应的微孔中。 |
2 | 在每一微孔中加入50ul褪黑激素生物素。 |
3 | 在每一微孔内加入50ul褪黑激素抗血清。 |
4 | 盖板，轻轻震板，2-8℃下温育14-20小时。 |
5 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的检测缓冲液洗板3次，吸水纸上拍干以除出残余液体。 |
6 | 在每一微孔中加入150ul临时配置好的酶联物。 |
7 | 盖板，室温（18-25℃）轨道振荡器上（500rpm）温育120min。 |
8 | 大约在温育结束10分钟前准备好PNPP底物液。 |
9 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的检测缓冲液洗板3次，吸水纸上拍干以除出残余液体。 |
10 | 如果有8道移液器，请用8道移液器加底物液和终止液，加底物液和终止液的时间间隔应当相同。使用主动置换型移液器并避免气泡产生。 |
11 | 在每一微孔中加入200ul临时配置好的PNPP底物液。 |
12 | 室温（18-25℃）轨道振荡器上（500rpm）温育20-40min。 |
13 | 在每一微孔中加入50ul PNPP终止液，轻轻震板以使溶液混合均匀。 |
14 | 加终止液后60min内在405nm处读取OD值。（参考波长：600-650nm） |
10、结果计算
在半对数坐标纸上或自动计算的方法，以标准品的OD值（Y轴，线性）对其浓度（X轴，对数）做一条标准曲线。使用三次回归、四参数或双对数曲线方程可以得到更好的标准曲线。在推算标准曲线时，应当充分利用好每一个标准品数值（明显逸出的数值应当被忽略，再使用更加合理的数值代替它）。样品的浓度可以从标准曲线上直接读取。从坐标纸上读取结果时应当把起始的稀释倍数考虑进去。将稀释了的样品结果乘以稀释因子即可得到其相应的结果。样品中抗体浓度高于最高标准品的样品，应当按实验前准备说明所述的方法进行稀释，并重新检测。
转换系数：褪黑激素（pg/ml）×4.30=pmol/l
典型标准曲线
（例子：不能用来定量）
标准品 | 褪黑激素(pg/ml) | 平均OD值 | OD/ODmax(%) |
A | 0.0 | 1.517 | 100 |
B | 3.0 | 1.383 | 91.1 |
C | 10 | 1.214 | 80.1 |
D | 30 | 0.867 | 57.1 |
E | 100 | 0.434 | 28.6 |
F | 300 | 0.260 | 17.1 |
11、期望值
实验结果不能当作确定治疗结果的唯一因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。对明显健康的一组人群进行研究发现，人体内的褪黑激素水平有着明显的生理周期变化，褪黑激素白天的水平很低，而晚上的水平则很高，而且个体之间的差异也很大。此外，褪黑激素的水平也与年龄有关系，其最高浓度是在婴儿（3岁）样品中发现的。对6个明显健康献血者的褪黑激素生理周期进行研究。褪黑激素大概在白天下午四点最低，其平均值是4.6pg/ml；早晨4点达到最好，平均值为77.5pg/ml。健康个体之间的褪黑激素最高值差异很大，建议每个实验室都确定自己实验室的正常值范围。
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
