R&D Systems试剂 Q&A 常见问题解答（五）
问：我用了DuoSet ELISA开发系统，但几乎就没有颜色产生。那些步骤可能出了问题？
答：很多方面都会影响到颜色的产生。比如：
1) BSA的干扰。选择不含脂肪酸的ELISA级别的BSA很重要，可以降低球蛋白对实验的干扰。R&D Systems建议使用Serological Proteins的BSA（目录#82-045）。
2) 非室温下的试剂在使用时会抑制信号；如果室温过低，信号也会被抑制。
3) 如果使用了未表明为“高结合性ELISA”的微孔板，捕获抗体同微孔板的结合就不牢固，从而导致测试的颜色产生过低。
4) 任何试剂，如果配制出错、储藏不当、或已过期，都将出现这一问题。
5) 读板时使用的波长同低物的波长不一致。
问：我是否可以使用你们的抗体配对ELISA中的抗体，但用另一家公司的蛋白为标准？
答：若使用一家公司的抗体而用另一家公司的标准的带来问题是它们会有不同的免疫活性（或不同的抗体与重组蛋白的结合力）。这种现象的出现是因为作为标准的重组蛋白同作为抗体免疫原的重组蛋白在蛋白序列或折叠中会有所不同，如果蛋白序列或折叠的不同发生在抗体结合部位，就会引起抗体对重组蛋白标准的不识别或识别很差。
ELISpot 酶联免疫斑点
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问：什么是ELISpot？ 答：R&D Systems的ELISpot测试采用了ELISA技术。先将对某一细胞因子专一的单克隆抗体固定于微孔板的PVDF膜上，再将经适当刺激诱导的细胞移液到微孔中，然后将整个微孔板放置在保湿的370CCO2培养箱中温育特定的时间；在温育的这段时间里，固定化的抗体与它们周围分泌细胞析出的细胞分子结合；洗掉细胞和未结合的分子，加入对这一细胞因子有特异性的生物素化的多克隆抗体；清除未结合生物素化的抗体，加入经streptavidin共轭的碱性磷酸酶；将未结合的酶从反应中洗除后，再加入底物溶液（BCIP/NBT）；一个蓝黑色的沉淀（斑点）在细胞因子产生的位置形成，每一斑点代表了分泌特定细胞因子的细胞。这些斑点可用自动读板系统（不同于普通读光仪）读出；或者，这些斑点也可用立体显微镜手控读出。 问：ELISpot与ELISA有何不同？ 答：ELISA实验测量的是样本中某一细胞因子的总量（一般表示为pg或ng /mL）；ELISpot实验并不测定样本中某一细胞因子的量，而是测定有多少细胞在分泌某一细胞因子。 问：ELISpot与组件有何不同？ 答：R&D Systems的ELISpot试剂盒含有：对某一细胞因子有特异性的单克隆抗体（这一抗体已预先固定在微孔板的PVDF膜上）、生物素化的检测抗体，Streptavidin共轭的碱性磷酸酶、BCIP/NBT产色物、和重组细胞因子阳性对照。试剂盒备有试验所需所有的用品，试验者不需再进行优化。
R&D Systems的ELISpot开发试剂分为两个必需组分，必须分别购买对细胞因子具有特异性的开发组件和ELISpot蓝色组件。对细胞因子专一的开发组件包括对细胞因子特异的捕获抗体和检测抗体；ELISpot蓝色组件（目录#SE002）对所有R&D Systems的对细胞因子特异的开发组件都适用，它包含Streptavidin-碱性磷酸酶和BCIP/NBT产色物。 问：我是否可只使用ELISpot试剂盒中的部分微孔板？ 答：因为带有PVDF膜的微孔板很灵敏，我们不能将微孔板做成条状的形式。如温育多次，我们将不能保证使用微孔板所得的实验结果；因为微孔板不再无菌，所以未使用的微孔可能有污染。我们并不担心第一次使用时污染会有，因为大多数的细胞培养液都含抗菌素，而温育时间又相对较短。我们选择带有的PVDF微孔板是因为它能比标准ELISA级别的聚丙乙烯(polystyrene)微孔板提供更好的实验结果。 问：我需要用多少细胞？ 答：这个问题比较难回答，根据实验要求而异。使用多少细胞有许多变量：比如细胞的大小、细胞的类型、分泌细胞因子的细胞的多少、诱导细胞的方法等。刚开始时，需要做一些细胞的稀释（如，将每孔10,000,000个细胞稀释到100,000甚至到10,000个细胞）来决定可形成明显斑点的最佳细胞数。例如，如果微孔中的细胞已达到单层融合状而大部分细胞分泌待测的细胞因子，形成的斑点就很难分开，这样就很难定量检测到分泌所测的细胞因子的细胞数；在这种情况下，应做一系列稀释(titration)，降低细胞数。如果在同样的单层融合状细胞中只有少数细胞分泌待测的细胞因子，形成的斑点就会很明显，就很容易被定量测定；在第这种情况下，细胞数目就是合适的。所以，必须针对不同细胞类型和诱导方法来确定每孔中应加入细胞的最佳数目。 问：在一个微孔板上可做多少个样本？ 答：这是基于96孔微孔板的测试。除去阳性对照、阴性对照、本底（空白）和检测抗体对照外，还剩下88孔，可做44个样本（每个样本做双份）。 |
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综述
