药物对动物腹腔巨噬细胞的影响实验（一）

实验方法原理

红景天苷不仅具有抗衰老、抗抑郁、抗癌、抗缺氧、保护肝脏、改善心脑血管功能和提高中枢神经系统功能等多种药理作用，还可以起到抗疲劳、抗缺氧、抗肿瘤、抗病毒和增强免疫功能的药理作用。巨噬细胞是机体免疫系统的重要递呈细胞，在特异性和非特异性免疫过程中均发挥着重要的作用。

实验材料 小鼠

试剂、试剂盒 Sal刀豆蛋白A 四甲基偶氮盐唑L-谷氨酰胺β-二巯基乙醇放线菌酮青霉素链霉素RPM Ⅱ1640培养基胎牛血清羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰亚胺酯2-7-二氯氢化荧光素乙二脂G riess试剂盒

仪器、耗材 酶标仪流式细胞仪荧光酶标仪

实验步骤

一、材料准备

1.  小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备

（1）将BALB/c小鼠眼球放血处死，用750 mL/L 乙醇消毒小鼠皮肤后。

（2）腹腔注射5 mL RPMI1640基础培养基。

（3）轻揉小鼠腹部5 min，从侧腹壁小心抽吸出液体，收集细胞到15 mL 的离心管中，于4℃以1500 r/min，离心5 min，弃上清，用RPMI1640基础培养基重悬，并将细胞密度调整为2×109个细胞/L，接种到96/24孔细胞培养板中，于37℃、50 mL/L CO2培养箱培养。

（4）3 h 后弃上层培养液，用冷的RPMI1640基础培养基轻轻洗涤2次，去除未贴壁细胞即得已贴壁的巨噬细胞。

二、实验步骤

1.  对照实验

（1）实验设置空白对照组（加DMEM完全培养液）、对照组（加巨噬细胞悬液）、Sal80 μmol/L 组、Sal160 μmol/L 组和Sal320 μmol/L 组，每组设3个复孔。

（2）将取密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种于96孔板中，每孔添加190 μL的RPMI1640基础培养基，并加入10 μL的Sal工作液，使其终浓度分别为80 μmol/L、160 μmol/L 及320 μmol/L，于37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养48 h。

（3）每孔加入20 μL （质量浓度为5mg/L）MTT，避光孵育4 h 后，离心（1500 r/min，5 min）弃上清，每孔加100 μL 二甲基亚砜（DMSO），于振荡器上避光振荡10 min 以溶解孔底紫色结晶，在酶标仪于490 nm 波长检测各孔吸光度值，并计算细胞的相对存活率。

（4）细胞相对存活率=[（不同浓度的Sal组的A值-空白对照组的A值）/（对照组的A值-空白对照组的A值）]×100%。

2.  采用MTT比色法检测

（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ组和Sal+LPS+IFN-γ组，每组设3个复孔。

（2）将密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种到96孔板中，每孔添加190 μL的RPMI1640基础培养基，并加入10 μL不同浓度的Sal（终浓度为80、160、320 μmol/L）培养4 h。

（3）加入LPS9（终浓度为10 mg/L）和IFN-γ（终浓度为80 μg/L），于37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养48 h。

（4）每孔加入20 μL的MTT（终浓度为5mg/L），继续培养4 h后离心（1500 r/min，5 min）。

（5）弃上清，每孔加入100 μL DMSO，震荡10 min，酶标仪于波长490 nm检测A值，并计算Sal对巨噬细胞的增殖促进率。

（6）促进率=[（Sal+LPS+IFN-γ组的A值—LPS+IFN-γ组的A值）/LPS+IFN-γ组的A值]×100%。

3.  采用SytoxGreen染色法检测

（1）实验设对照组、CHX和Sal+CHX组，每组设3个复孔。

（2）将密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种到96孔板中，添加190 μL RPMI1640基础培养基，将10 μL终浓度为160 μmol/L的Sal工作液加入到贴壁的巨噬细胞中。

（3）培养4 h 后，在CHX组加入终浓度为0.5 μmol/L 的CHX，继续于37℃、50 mL/L CO2孵箱中培养48 h。

（4）加入终浓度为0.5 μmol/L的Sytox??Green对96孔板中的巨噬细胞室温下染色15 min，用荧光酶标仪检测巨噬细胞Sytox  Green染色的荧光强度。