一些分子生物学实验小技术-2
5．有关融合蛋白表达载体的克隆
在构建融含蛋白表达载体时除了要注意插入片段的方向、读码框架与载体保持一致外，注意以下问题可能会减少一些不必要的麻烦，当外源片的插入载体起始密码的后面，另一个基因的前面时，注意检查插入后基因的两端是否引入了新的终止密码，特别是用到Klenow
mung bean 核酸酶，T4 Polymerase
补齐，去粘末端等技术调整读码框时或不同酶切位点粘端连接时要注意。如XbaI识别序列隐含终止密码，调整码框时就要注意，又如BamH
I酶切粘端为GATCC ＿补平后如果接到T
后面就有可能形成TGATCC这种隐含终止密码的情况。（还有外源基因本身不可带终止密码）另外要注意启动子后面避免出现几个靠近的不同框架的ATG
，以减少对表达的影响。如果插入片段插到载体终止密码前和另一个基因后面，则只用注意插入片段前方是否有终止密码即可。
6．关于酶切
A．找不到适合的酶切位点。由于各厂家不定期的推出新的限制性内切酶品种，这些酶切识别序列可能尚未在有关Catalog
上出现，用现有的软件也查不到这些酶切点，如New England Biola
公司前一段时间刚推出了20多种新的内切酶。请随时向各厂家或供应商查询，并记得将新的品种加入到您的记录中以便查阅，这些新的内切酶有可能正是您要找的呢。
B．在文献上找到的内切酶在厂家目录上找不到。由于来源不同，许多识别序列，酶切点完全本同的酶会有不同的名字，各供应商目录往往会有相应的附录以供用户查询，比如在New
England Biola 的Catalog
后面20项或基因有限公司2000Catalag前面都附有相当完整的内切酶列表（含1999年以前绝大部分商品化的酶），从左边一栏寻找你已知的酶的名字，找到后可以查出相应的识别序列，各种同功酶的名称，
酶在NEB 厂家所用的名称和目录号等。另外也可以通过已知酶的识别序列在相应的表中找到相应的酶名称。当然这些表可能不含最新发现的酶。
C．Dam Den 甲基化对酶切点的影响。有时用试剂盒纯化的质粒用别的酶都切得动，用Bcl I
，等酶就是切不动。原因在于多数实验室常用的Ecoli
菌株都有甲基化的功能，而BclI是一个甲基化敏感的酶。当其识别序列被甲基化后BclI就出现切不动的情况。而Bam
HI则对甲基化不敏感，所以甲基化与否都照切不误。当你要用BclI这类切点时，请选用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119
或其他菌种。有的内切酶对甲基化敏感与否取决于其识别序列两端的碱基，详细资料请参考厂家目录的有关附录，如NEB 目录268 、269 页。
D．同进进行双酶切要注意：
①任何时候2
种酶的总量不能超过反应体系的0.1②双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表（NEB
目录251 ）页，如果有一种buffer能2 使种酶的活力都超过70% 的话，即可用这种buffer.
如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可各取一半中和。
③如果2 个酶buffer成份相差较大或2 个酶的反应温度不同则必需分别做酶切。厂家目录一般都会有相应的附录以供查询各种酶的反应温度。
④第一个酶切后可以电泳确证酶切完全后从胶中回收DNA 再进行下次酶切也可以在第一个酶切后用PCR 产物回收试剂盒或Nucleotide
Removal Kit纯化酶切样，保留少量做电泳分析之用后再进行下一次酶切。还有一种屯化管（eendorf
等厂家有售），将酶切样加入后离心，盐等成份被甩掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入ddH2O
离心洗涤后加几微升在膜上，将柱子反转插入新的eerdorf 管上离心即可将DNA 片段离下来，做下一次酶切。
⑤特别注意，双酶切载体时如果2
个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序，因为不同的内切酶对其识别位点两端碱基数目要求不同，有的酶要求识别序列两端有多个碱基的必须先切，比如LITMUS29中先切BamHI
再切Hind 时就会出现切不动的情况。更详细的数据可参考相应的附录，如NEB 公司目录的259 页。
E．设计合成引物时加入酶切点往往为后继的实验带来很多方便，比如PRC
产物经酶切后可以定向克隆到载体中，但在设计时需注意不同的限制性内切酶对其识别位点两端的碱基数目要求不同。例如HindⅡCla
Ⅰ，要求其识别序列5
端至少有多个碱基，这个酶才能切动，有的内切酶在两端碱基不同时切割效率也不同，设计引物时要特别注意。有关数据可查询各供应商附录表，如NEB
公司第258-259 页。
F．小量酶切时用较小的管化1.5 的管好，可以减少因为蒸发造成的体积减少，浓度改变。
7 、 有些酶切补齐后再连接会产生新的酶切位点
可以用来验证是否补齐连接成功，例如Bam HI酶切补齐再连接后产生的序列可以被cla Ⅰ，ＤⅡ，Taq
Ⅰ所切动。详细资料可查询供应商的附录，如２６４－２６５8 、 有些酶的识别位点不同但产生的粘端是匹配的，可以直接连接Ⅱ，如Bcl I ，Bam
HI和Ｂgl Ⅱ，酶切产生的粘端就是匹配的，可以直接连接。详细资料可参考供应商的附录如NEB 目录的２６６－２６７9 、
各供应商送货时往往会提供冰袋，在室温下将化冻的大冰袋平整的一面整齐地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml
的废弃离心管；或将几个小冰袋（化冻后）填料塞入一个小泡沫盒中压实，再插入各种大小的废管，放在-20
摄氏度冻24小时后了取出，拔出插入的废管（可加点热水以助拔管）即可做成一个科易冰盒，可在室温下保持6-24小时的低温呢（平时要在-20
摄氏度放置）在制冰机有问题或停电时就不用怕了。 10、用CLP 的10ml/200ml 两用ti盒，这种盒的芯可调的，可以放10ml的小ti
，也可调整为放２００ml tip的盒，根据需要随时转换非常方便。
8．双酶切小技巧
A．任何时候2 种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。
B．双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表（也可以向ebiotrade.com客户服务部索取），如果有一种buffer能同时使2
种酶的活力都超过70% 的话，就可以用这种buffer作为反应buffer.
如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和。
C．如果2 种酶的buffer成份相差较大或2 种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1
种酶切后要考虑用酚抽、电泳或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，有的则不行，这些信息也可以在有关附录中查询，也可以向ebiotrade.com客户服务部索取。
D． 第一次酶切后通过电泳确证酶切完全后可以从胶中回收DNA 片段再进行下次酶切，也可以在第一个酶切后直接用PCR
产物回收试剂盒或Nucleotide Removal Kit 纯化酶切样（只需5
分钟），保留少量样品做电泳分析之用，再进行下一次酶切。还可以用一种离心纯化管或叫做离心浓缩管（Eendorf ，am
等厂家有售），将酶切样加入后离心，盐等成份被过滤掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量ddH2O
，离心以洗去膜上残留的杂质，再加几微升ddH2O 在膜上，将柱子反转插入新的eendorf 管上，离心，即可将DNA 片段离下来，做下一次酶切。
E．特别注意：在双酶切载体时如果2
个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。比如质粒pLITMUS29
的多克隆位点中BamH I旁边有HindIII 位点，如果先切BamH I再切HindIII 时就会出现HindIII
切不动的情况，但是反过来就没问题。更详细的数据可参考相应的附录，也可以向ebiotrade.com 客户服务部索取。
9． Dam Dcm 甲基化对酶切的影响。
有时质粒用别的酶都切得动，用Bcl I 、Cla I
等酶就是切不动。原因可能在于多数实验室常用的E.coli菌株都有甲基化的功能，而BclI是一个对甲基化敏感的酶。当其识别序列被甲基化后BclI就出现切不动的情况。而BamH
I则对甲基化不敏感，所以甲基化与否都照切不误。当你要用BclI这类切点时，请选用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119
或其他菌种。有的内切酶对甲基化敏感与否取决于其识别序列两端的碱基，例如Cla I ，3 ‘端相连的碱基为C
时就会对甲基化敏感。这样的酶有好几种，详细资料请参考厂家目录的有关附录，或向ebiotrade.com 客户服务部索取。
小玩意
1 、 各供应商送货时往往会提供冰袋，在室温下将化冻的大冰袋平整的一面整齐地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml
的废弃离心管；或将几个化冻后的小冰袋填料塞入一个小泡沫盒中压实，再插入各种大小的试管，放在-20
摄氏度下冻24小时后取出，拔出插入的废管（可加点热水以助拔管）即可做成一个简易冰盒，可在室温下保持6-24小时的低温呢（不用时要放在-20
摄氏度下存放）。在制冰机有问题或临时停电时就不用怕了。
2 、有一种10μl/200 μl 两用ti盒，这种盒的芯可调的，可以放10μl 的小ti ，也可调整为放200 μl 的ti，根据需要随时转换，非常方便。
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