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酶标仪助力伪病毒研究

2021.3.08

酶标仪可以做啥？

ELISA，核酸蛋白定量，抗原抗体分析，酶动力学，细胞活性分析，分子间相互作用，内毒素检测……

今天要给大家分享的是酶标仪用于Pseudovirus entry assays伪病毒进入分析。

最近Alexandra C. Walls等¹在Cell发表了一篇文章。文章表明SARS-CoV-2作为一种新近出现的病原体，与人ACE2具有高亲和力，并将其作为入侵靶细胞的受体。同时证明了SARS-CoV S鼠多克隆抗体有效地抑制了SARS-CoV-2 S介导的进入细胞，这表明接种疫苗后可以诱导产生靶向中性S抗原决定簇的交叉中和抗体。为疫苗和治疗剂的设计提供了蓝图。

Pseudovirus entry assays伪病毒进入分析实验流程如下：

在10％FBS，1％PenStrep DMEM培养基中培养VeroE6和BHK细胞。将BHK或VeroE6细胞以0.3×106的密度接种到12孔板中培养16小时。部分BHK细胞不进行转染，另一部分BHK细胞采用lipofectamine 2000（ThermoFisher）的标准方案，每孔用0.8μg ACE2转染，再孵育16小时。用DMEM洗涤3次后，向孔中加入20uL浓缩的假病毒。2-3小时后，将含有20％FBS和2％PenStrep的DMEM加入细胞中培养48小时。感染48小时后，将One-Glo-EX以相同的培养体积添加到细胞中，并在黑暗中孵育10分钟，然后在Varioskan LUX多功能酶标仪（ThermoFisher）上进行数据读取。对于进入抑制分析，在室温下将1：100稀释的血浆与等量的假病毒孵育30分钟，然后添加标准化量的假病毒到细胞中感染细胞。一式三份进行测量，并绘制相对荧光素酶信号（RLU）图形。

图1. ACE2是SARS-CoV-2 S的功能性受体

（A）用SARS-CoV-2 S，SARS-CoV S和SARS-CoV-2 Sfur / mut假型的MLV的进入VeroE6细胞。数据表示为平均值±三次技术重复的标准偏差。

（B）用SARS-CoV-2S或SARS-CoV-2Sfur / mut假型的MLV进入hACE2瞬时转染的BHK细胞中。用两种独立的假病毒制剂进行实验，并显示了其代表性实验。数据表示为平均值±三次技术重复的标准偏差。

结果表明

研究使用鼠白血病病毒（MLV）假分型系统S介导进入靶细胞的功能决定因素（Millet and Whittaker，2016）。为了评估SARS-CoV-2 S促进进入靶细胞的能力，研究者首先比较了SARS-CoV-2 S-MLV和SARS-CoV S-MLV向VeroE6细胞的转导，已知这些细胞表达ACE2和支持 SARS-CoV复制（Drosten et al., 2003; Ksiazek et al., 2003）。两种假病毒均能很好地进入细胞（图1A），这表明SARS-CoV-2 S-MLV可以使用非洲绿猴ACE2作为进入受体。为了证实这些结果，研究者评估了进入BHK细胞的过程，并观察到hACE2的瞬时转染使其易于被SARS-CoV-2 S-MLV转导（图1B）。这些结果表明，hACE2是SARS-CoV-2的功能性受体，与最近报道的发现一致（Hoffmann et al., 2020; Letko et al., 2020; Zhou et al., 2020）。

另一篇是Young-Jun Park等²发表在Nature Structural & Molecular Biology上的文章。中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）会导致人类严重的甚至致命的呼吸道疾病，因此没有疫苗或特定的治疗方法。研究表明通过识别一个保守的沟槽，该沟槽对于MERS-CoV S介导的唾液酸化物进入人体气道上皮细胞至关重要。其数据阐明了MERS-CoV S唾液苷的特异性，并表明与α2,6-连接的受体相比，对α2,3-连接的选择性是与前一类寡糖相互作用增强的结果。本研究提供了一个结构框架，说明MERS-CoV附着于唾液酸苷受体，并识别抑制病毒进入的潜在脆弱性位点。

Pseudovirus entry assays伪病毒进入分析实验流程如下：

制备MERS-CoV S假型的鼠白血病病毒。使用Lipofectamine 2000或3000转染试剂按照制造商的说明使用（ThermoFisher），将HEK293T / 17细胞与全长MERS-CoV S或MERS-CoV S突变体编码质粒，鼠白血病病毒Gag-Pol包装构建体以及编码荧光素酶报告基因的鼠白血病病毒转移载体共转染。用转染培养基将细胞在37°C和8％CO2下孵育5–12小时。然后将细胞用DMEM洗涤两次，并加入含有10％（vol / vol）FBS的DMEM培养达72小时。然后收集上清液，并通过0.45μm膜过滤，然后用30 kDa离心浓缩器膜（Amicon）浓缩。

胰蛋白酶消化后，将含有10％（vol / vol）FBS和1％（vol / vol）PenStrep的DMEM中生长的Calu-3细胞以每毫升〜3.2×104个细胞的密度接种到96孔板中，使其生长。在37°C下以8％（vol / vol）的CO2进行48小时。将细胞用DMEM洗涤3次，添加40μl MERS-CoV S或MERS-CoV S突变型假病毒于37°C，8％（vol / vol）CO2的条件下培养2h。温育2小时后，将40μl的20％（vol / vol）FBS和2％（vol / vol）PenStrep加入孔中，并将板温育72小时。以等体积添加ONE-Glo-EX（约75μl，以解决蒸发），并在Varioskan多功能酶标仪上读取荧光素酶信号数值。

图3 配体结合位点是MERS-CoV S介导的唾液酸内分泌并进入人气道上皮细胞的必需位置。

b，MERS-CoV S F39A，H91A，S133A或R307A突变抑制了假型鼠白血病病毒颗粒进入人气道Calu-3细胞。相对于野生型将数据标准化，并显示为平均值和标准差。n = 3个伪病毒实验（技术重复）。

Extended Data 5 | SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。

b，使用抗MERS-CoV S1多克隆抗体对用野生型或突变体MERS-CoV S假型化的鼠白血病病毒颗粒进行Western印迹分析。未裁剪的污点图像可用作源数据。

结果表明

由于分别破坏涉及Neu5Ac C1羧酸盐和甘油侧链的上述静电相互作用，S133A和R307A突变体消除了假型病毒颗粒的进入（图3b和Extended Data图5b）。F39A和H91A突变体显示假型颗粒的传染性降低了90％以上，这可能是由于配体结合凹槽的破坏和有利的范德华力或静电相互作用的丧失（图3b和扩展数据图5b）。

Varioskan LUX多功能酶标仪