遗传病的基因诊断

根据出生缺陷监测和残疾儿调查结果显示，我国是出生缺陷高发国家，每年有近100万出生缺陷儿发生，30％在出生前后死亡，40％造成终生残疾，只有30％可以治愈或纠正。在这些出生缺陷儿中，80%是由于遗传因素造成的。如果能对这些患儿进行症状前诊断或产前诊断，给予及时而适当的治疗和预防，其经济和社会效益是不言而喻的。 

目前我国几个主要的医学遗传中心能检测的基因诊断项目有20多种，包括唐氏综合征（Down syndrome）、13三体（又称Patau综合征）、18三体（又称Edwards综合征）、地中海贫血（thalassemia）、甲型血友病( hemophilia A )、进行性肌营养不良（DMD/BMD）、 苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）、脆性X综合征（fragile X syndrome）、马凡氏综合症( Marfan syndrome)、Prader-Willi综合征、脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA )、软骨发育不全（achondroplasia）、亨廷顿舞蹈病（Huntington disease , HD）、结节性硬化症( tuberous sclerosis )、特发性无精症（idiopathic azoospermia）、两性畸形( hermaphroditism)、成人型多囊肾病（adult polycystic kidney dicease, APKD）、粘多糖贮积症Ⅱ型( mucopolysaccharidosesⅡ,MPSⅡ)、遗传性视神经病(Leber's hereditary optic neuropathy，LHON )、成骨不全 I 型( osteogenesis imperfecta，OI )、视网膜色素变性（retinitis pigmentosa）等。下面将我国发病率较高，导致出生缺陷危害较大的几种遗传病作一些简单的介绍，在今后的专题中，我们将具体讨论各主要遗传病的基因诊断研究进展。 



1 染色体异常疾病 



唐氏综合征：在我国，新生儿中的平均发病率为1/750。唐氏综合征胎儿的风险随着孕妇年龄的增加而升高。研究证明21号染色体特定的区域（q22.2片段）与该病典型的表现型有密切的关系，称为唐氏综合征关键区域（Down syndrome critical region,DSCR）。目前较普遍采用PAPP-A+AFP+hCG三联法进行筛查，而诊断中应用较多的是FISH，但无法检测易位型（约占5%）。其他的如同源基因半定量法、荧光定量PCR法等，已在一些实验室中进行。 

另外两种常见的非整倍体染色体异常：13三体和18三体，新生儿发病率分别为1/5000和1/1000。已有研究报道利用QF-PCR平台，使用单管同时检测21、13、18三条染色体上的12个STR位点 ,根据等位基因片段的荧光强度比值直接诊断这三种常见的染色体病。这种方法同样适用于性染色体异常的疾病，如Turner综合征（占新生儿的1/5000）。 

Prader-Willi综合征：新生儿发病率1/10000，其机制是基因组遗传印记效应。在卵细胞减数分裂1期母源性15号染色体单亲二体发生的染色体不分离导致Prader-Willi综合征。对其关键区域基因SNRPN基因的DNA甲基化分析是对该病进行诊断的最准确方法，可以将缺失、非平衡易位、单亲二体和印记突变的所有病例检测出来，敏感度高。 



2 血液系统遗传病 



血液系统相关的遗传病较多，以下列举出国内已经开展产前诊断的几种常见遗传病：包括地中海贫血、G6PD缺乏症及血友病。 

地中海贫血是我国南方各省常见的遗传疾病，发病率高，其基因研究深入，突变明确，是产前分子遗传诊断的重点，常见的有α地贫和β地贫。 

α地贫: 两广地区（广西和广东）群体筛查携带者频率分别高达14.95% 和8.3% 。我国α地贫的分子基础主要是大片段基因缺失-SEA , -α3. 7 和-α4. 2 为最常见的3 种基因缺失类型，非缺失型α 地中海贫血主要是Hb CS和Hb QS 。筛查方法有：红细胞脆性单管法、平均红细胞体积、铁蛋白测定及血红蛋白电泳等，根据各实验室的条件而定，目前已有市售筛查试剂盒。分子诊断则是根据基因突变的类型，对缺失型和非缺失型分别采用不同的方法检测。已有市售的裂口PCR（Gap-PCR）诊断试剂盒用于诊断缺失型；对于非缺失型，有研究人员设计出四引物等位特异性PCR，单管同时检测我国常见的非缺失型Hb CS和Hb QS 。 

β地贫：广东省群体筛查携带者频率为3.36% ,其分子基础以点突变为主，中国已发现27种β-珠蛋白基因点突变 , 反向点杂交（reverse dot blot,RDB）是目前国内外常用的检测技术，其优点是可以同时筛查17种点突变，但操作稍复杂，使用探针的成本也较高。突变特异性扩增（ARMS）法同时检测多种已知点突变，可以应用于国内5种最常见突变（约占90%）的筛查，该法简便、经济，易于推广。 

G6PD缺乏症：是某些药物性溶血、感染性溶血、蚕豆病及重症新生儿黄疸发病的遗传学基础。我国此病的流行病学特点, 即：①基因频率介于0. 0000～0. 4483之间 ,最高的基因频率发现于海南一苗族半隔离群; ②分布呈“南高北低”的趋势。红细胞G6PD活性测定是诊断本病的主要依据，该技术简单，通常用于筛查，特别是用于样本较大的群体。G6PD基因突变具有高度的遗传异质性，现已发现引起中国人G6PD缺乏症的主要突变1376G→T、1388G→A、95A →G 三种,占已知基因突变的60 %～85.0 %， G6PD基因突变检测最常用错配扩增酶切法和ARMS法。 

甲型血友病是FVIII基因突变导致的凝血功能障碍性遗传病，呈X连锁隐性遗传，发病率为1/5000男性活婴。目前国内进行基因诊断的方案采取三大步骤：首先看是否有倒位突变。内含子22的倒位突变约占50%重型患者，因为扩增的片段较长（>10kb),需要使用长片段PCR扩增试剂盒。如果倒位阴性，第二步检测二核苷酸重复（CA）n多态；最后使用RFLP进行连锁分析。这样约90%以上的患病家系可以得到可靠诊断。目前我国仅有约５％的血友病患者得到明确诊断，开展该病的基因检测，可以使更多的血友病患者避免创伤、更多的携带者接受产前诊断。 



3 动态突变疾病 



脆性X 综合征：在常见的遗传性智力低下疾病中,，发病率仅次于唐氏综合征，占所有智力低下患者的2.6%~8.7% 。遗传机制是由于FMR1基因中位于第一个外显子的（CGG）n重复序列异常扩增而致病。诊断主要是用分子遗传学方法，用PCR直接扩增FMR1基因的（CGG）n重复序列或者使用甲基化敏感的内切酶检测甲基化状况。应对不明原因的智力低下儿童进行大面积筛查,尤其是对有智力低下家族史的孕妇进行产前筛查,以防止患儿出生。 

亨廷顿病：本病的分子基础是位于4p16.3的IT15基因编码区多态性位点CAG重复序列增加超过其正常变化范围所致。此多态CAG重复序列不稳定，在亲子传递中其重复次数可能会增加，尤其是经父亲传递，正常人群CAG重复次数为6-35，患者CAG重复次数超过40，甚至上千次。患者的临床表现与CAG重复数不相关，但其症状的严重程度和发病年龄与CAG重复数呈正相关。通过特异性的PCR和Southern 印记杂交能确定所有被检测样本CAG重复数。 

遗传性脊髓小脑性共济失调：是一系列常染色体显性遗传病，病变涉及脑干和脊髓，主要病理改变是小脑和其传出和传入系统的退行性病变。这些病的分子基础是在位于不同染色体上的相关基因相关区域多态性位点CAG重复序列增加所致，除SCA10（ATTCT重复）和SCA8（CTG重复）。这些重复序列不稳定，在亲子代传递中其CAG重复序列可能会增加。通过特异的PCR扩增和Southern 印记杂交可确定所有样本的重复次数。 



4 神经、肌肉组织遗传病 



杜氏肌营养不良（DMD）：X 连锁隐性致死性遗传病，发病率约占男性活婴的1/3000。DMD基因突变以缺失为主，占50%~60%；重复突变次之，占5%~10%。分子遗传学检查是确诊本病的主要手段，有以下几种：应用多重PCR可检测95%以上的缺失突变，因为实验简单、快速、直接而成为首选。如果没有检测到缺失，而家系中又有先证者时，可以选用5~6个多态标记进行连锁分析来间接诊断。目前，应用DHPLC （Denaturing High Performance Liquid Chromatography，变性高效液相色谱）技术进行全基因外显子突变筛查，可以使直接诊断率提高到95% 。应用 RT-PCR分段扩增，检测DMD基因缺失、重复及剪接突变也在一些实验室中进行。 

脊髓性肌萎缩症：基因定位于5q12-13,婴儿型的发病率在1/1万左右，其突变基因的携带者比例高达1/50。分子诊断主要检测SMN基因的缺失，应用PCR-RFLP法诊断的准确性相当高，约90%的患者得以确诊，成为目前临床诊断的主要方法。另外，应用定量PCR检测SMN基因的重复拷贝数，也是诊断该病的一个重要补充。 



5 其 它 



苯丙酮尿症：是一种以智力低下为特征的先天性代谢缺陷，我国的平均发病率为1/16500，北方较南方发病率高。基因定位于12q24.1，突变类型100余种，以点突变为主。我国大部分城市已开展新生儿筛查，主要采用细菌抑制法和干血片荧光分析法。产前诊断主要是针对突变热点的外显子进行筛查，未查到突变，若家系中存在先证者，则利用基因的多态标记进行连锁分析。 

Leber’s遗传性视神经病：是第一个已知与线粒体DNA点突变有关的人类疾病，好发年龄在12~30岁。目前已发现11种不同的线粒体DNA错义突变与该病有关，其中检测两种最常见的突变可以诊断出约90%的患者。



6 结 语 



目前迅速发展的分子生物学技术对已知突变基因检测的特异度和敏感度都很高。因此，基因诊断是属于诊断性检查，所得到的结果常常可以作为最后确诊的依据。理论上，任何胎儿细胞标本都可以用于分子遗传诊断。临床上使用最多的是未经培养或经过培养的羊水细胞，而绒毛细胞也是常用的标本。绒毛细胞特别有利于早期诊断。由于分子遗传诊断的敏感度非常高，所需要的标本量少，而且能在孕早中期进行诊断，是防止出生缺陷的重要手段之一。从事产前诊断的临床医生必须掌握不同的遗传诊断方法的适用性以及不同遗传病的致病机制，才能够正确地应用不同的遗传诊断方法，为病人提供有助于诊断的遗传信息，从而有效地干预出生缺陷， 优化人口结构，提高国民的整体素质。