Nature：CRISPR浪潮席卷学界
每当有新的CIRSPR-Cas9相关文章发表时，Addgene公司的工作人员就会迫不及待地研读。Addgene是家非盈利公司，研究者们把自己使用的分子工具存放在这里，以供其他科学家们尽快使用这一技术。Addgene公司执行董事Joanne Kamens 指出，一篇大热的论文一发表，几分钟内他们就会接到咨询电话。
早在2013年，研究人员就首次报道了使用CRISPR-Cas9系统切除人类细胞中特定位点的基因的研究。此后，Addgene的电话就一直处于忙碌状态。Kamens 表示，全体员工都忙着接电话。分子生物学家们迫不及待地想使用这个技术，因为这个技术能简便精准地对各个生物的基因进行编辑。Addgene配送了60000 个CRISPR相关分子工具——占其配送试剂总量的17%，这些工具被送到 83个国家的研究人员手里。单单2015年一年，该公司CRISPR相关页面浏览次数就超过一百万次。
许多关于CRISPR-Cas9的讨论都围绕着其在治疗疾病或编辑人类胚胎基因上的潜力。但研究人员指出，真正的革命发生在实验室。CRISPR最突出的优点是特异性：在广阔的基因组里靶向到目标位点。基因编辑只是CRISPR众多用处中的一个。科学家们正在研究使用CRISPR系统将蛋白质精确地递送到目标基因处，激活或抑制该基因。更宏伟的目标包括编辑整个生物网络，实现理解细胞系统和疾病这一长期目标。
波士顿儿童医院（Boston Children's Hospital）的血液学家Daniel Bauer表示，对于分子生物学家，CRISPR是强有力的研究基因组的工具。而南加利福利亚大学（University of Southern California）的分子生物学家Peggy Farnham补充，CRISPR能有助于解答很多以前无法解答的问题。
破碎的剪刀
CRISPR-Cas9系统有两个主要成分：剪切DNA分子的双分子剪刀Cas9酶，和一个小的、把剪刀靶向到特定DNA序列的RNA分子。细胞的固有DNA修复机制一般会修复断裂处，但往往会出错。
对于那些想要通过基因沉默来研究基因功能的研究者来说，这是个福音。遗传毫无人情可言：修复过程中引入的一个小错误可以完全改变其编码的蛋白质，或者完全停止该蛋白的合成。因此，科学家可以研究，当一个基因被沉默时细胞或生物体会发生哪些事情。
但也有不同的修复途径，即根据DNA模板修复断裂处。这就意味着，如果研究人员提供模板，那么他们可以在任意位点插入或删除任意序列。
2012年，各个实验室投入到证明基因编辑在人类DNA上的可行性的竞赛中时，一个团队采取了截然不同的做法。“我们做的第一件事是我们把剪刀打碎。”加利福利亚大学（University of California）的系统生物学家Jonathan Weissman这样说道。
Weissman从斯坦福大学（Stanford University）的合成生物学家Stanley Qi那里学到这一技术。Qi突变了Cas9酶，突变后，Cas9依然与向导RNA靶向的DNA序列结合，但并不切割该序列。相反，Cas9停留在该处，阻断该DNA转录成RNA。这样一来，不用改变DNA序列，就能够沉默基因。
然后Weissman等人利用这种突变的Cas9做了一些新的尝试，例如，将其与另一种能激活DNA转录的蛋白质结合在一起。利用这些技术，他们能随意控制基因的“开”和“关”。
几个实验室都在这种方法的基础上建立了一些新方法，更多的实验室迫不及待地在自己的研究中使用CRISPR。一种流行的做法是快速产生几百种不同的细胞株，每个CRISPR系统包含一个不同的向导RNA分子，靶向不同的基因。另一名加利福利亚大学的系统生物学家Martin Kampmann希望筛选这些细胞株，看看打开或关闭特定基因是否会影响暴露于毒性蛋白聚集体下的神经元——几种神经退行性疾病的发病机制之一——的存活。
Kampmann之前使用小干扰RNA（一种沉默基因的技术，可以同时处理多个分子）来完成这样的筛选。但小干扰RNA技术有缺点——脱靶效应显著。相比而言，CRISPR的特异性更高。
Weissman等人，包括加州大学的系统生物学家Wendell Lim，进一步优化了CRISPR系统，延长了导向RNA的长度，增加了能与不同蛋白结合的基序。这样，在同一个实验里，可以同时激活或抑制三个不同的位点。Lim认为，这个系统能同时处理多达五个位点。
他表示，位点数目的限制主要在于能进入细胞的向导RNA长度和蛋白大小。其实还是有效载荷的问题。
麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology）合成生物学家Ron Weiss也投身到了CRISPR的狂潮中。Weiss等人也在单个实验里，实现了多个基因调控，从而更快、更容易地建立复杂的生物通路，例如，把细胞的代谢机制转化为生物能源工厂。Weiss指出，合成生物学最重要的目标是通过创造这些复杂的通路，构建复杂的行为。
CIRSPR表观遗传学
当遗传学家Marianne Rots开始职业生涯时，她想发现新的医疗方法。她研究了以基因突变为靶点的基因疗法。但几年后，她决定改变策略。现工作于荷兰格罗宁根大学医学中心（University Medical Center Groningen）的Rots认为，很多疾病是受多个基因突变影响的，单基因遗传病非常少。最好的方法是控制基因的活力，调控表观组学，而非单单关注基因本身。
表观基因是指添加到DNA或组蛋白上的一些化学化合物。这些化合物能调控基因的表达。随着时间的推移，这些遗传标志也会发生变化：随着个体的发展及环境变化，它们会被添加或删除。
在过去的几年中，数以百万计的美元流入了编写人类细胞表观遗传标记目录的项目中。人们发现，这些表观遗传标记与各种生理活动紧密相关，例如脑活动和肿瘤生长。但是过去科学家们没有改变特定位点表观遗传标记的工具，所以无法确定表观遗传标记的变化是否会导致生物变化。阿拉巴马大学（University of Alabama）伯明翰分校的神经学家Jeremy Day指出，这个领域由于缺乏适当的工具，直接研究基因的功能和表观遗传标记的功能，因此一直遭遇诸多阻力。
CRISPR-Cas9扭转了这一局面。2015年4月，北卡罗来纳州杜克大学（Duke University）的生物工程学家Charles Gersbach等人发表论文，报道了一种使用失活的Cas9为基因组特定位点的组蛋白添加乙酰基——一种表观遗传标记——的系统。
研究小组发现，与DNA缠绕的组蛋白被乙酰化后，足以大幅度增加靶基因的表达水平。这证实了该系统的有效性，以及在这个位点，表观遗传标记有激活基因表达的功能。论文发表后，Gersbach把酶存储到了Addgene公司，供其他研究小组使用——确实有很多小组很快就使用Gersbach的这一技术。Gersbach预言，一大波证明同时操控多个表观遗传标记能产生协同作用的论文正要来袭。
但这些工具仍需改进。几十种酶可以添加或删除一个表观遗传标记，但并不是所有的酶都适合融入失活的CRISPR系统。Gersbach表示，这比很多人预想的要难得多，很多分子与Cas9耦合后，根本不发生作用。可能的原因非常多，例如可能是研究方法没有发挥作用，也可能是表观遗传标记在特定的细胞或环境里不起作用。但具体是哪个原因非常难以确定。
Rots之前使用旧的基因编辑工具锌指蛋白来研究癌症相关表观遗传标记的功能，现在她开始改用CRISPR-Cas9。她指出，CRISPR-Cas9已经席卷了整个领域，并已经产生了广泛的影响。人们常说，相关性是巧合——因为你改变了表观遗传，但它对基因表达没有影响。 但现在测试表观遗传标记对基因表达的作用非常简单，很多人都加入到这个领域中了。
CRISPR代码破解
DNA上的表观遗传标记并不是唯一有待解析的基因组密码。超过98%的人类基因组不编码蛋白质。但是研究人员认为，很多非编码DNA也有重要作用。他们正采用CRISPR-Cas9来探索这一谜题。
一些DNA编码，如miRNA和长链非编码RNA等RNA分子。人们认为，这些RNA分子具有除开制造蛋白质以外的功能。一些序列是按需增强基因表达的增强子。大部分与常见疾病风险相关的DNA序列位于非编码RNA和增强子区域。但在CRISPR-Cas9问世之前，科学家们很难研究这些序列的具体作用机制。Bauer指出，过去很难解析这些序列的功能，但现在的实验更精细。
Farnham等人利用CRISPR-Cas9删除与前列腺癌和结肠癌相关的增强子区域的突变。结果有时让她感到惊讶。在一项未发表的实验中，她的团队删除了一个被认为很重要的增强子，但与它相邻的一百万个碱基中没有基因发生了表达上的变化。她表示她们会对一个调控元件的影响力进行分类，但很多时候删除它，你会发现和原来的分类不符。
研究人员利用CRISPR-Cas9研究大片调控DNA时，会得到更多惊喜结果。由麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology）遗传学家David Gifford、杨百翰大学（Brigham Young University）遗传学家Richard Sherwood以及波士顿妇女医院（Women's Hospital in Boston）领头的小组使用CRISPR-Cas9技术对40000个碱基的序列引入突变，然后检查是否每个突变会对附近的、能产生荧光蛋白的基因的活力产生影响。这个项目最后得到一幅增强基因表达的DNA序列图，其中包括一些基于基因调控特征，如染色质修饰无法预测到的序列。
即使使用CRISPR-Cas9，也难以深入研究这些非编码DNA序列。Cas9酶在向导RNA的引导下，切割序列。但要求是该序列旁边存在一个常见却特异的DNA序列。这对于想要沉默基因的研究者来说不成问题，因为这种重要的序列基本都存在于目标基因内的某处。但是对于那些想对短的、非编码RNA序列进行特异性修饰的研究者来说，可选择的RNA配对序列非常有限。荷兰癌症研究所（Netherlands Cancer Institute）的研究人员Reuven Agami表示，并不是所有序列都适合作为靶向序列。
研究人员在细菌王国里寻找Cas9的近亲，希望能找到识别不同序列的DNA切割酶。去年，哈佛-麻省理工学院博德研究所的张锋团队发现了Cpf1家族，与Cas9有类似的工作机制，能扩大序列的选择范围。但Agmai指出，目前没有一种替代酶比Cas9有效。在未来，他希望有完整的DNA切割酶工具盒，可以靶向基因组的任意位点。但目前还未实现这一目标。
当CRISPR邂逅光
Gersbach的实验室使用基因编辑工具，以了解细胞命运和如何调控细胞命运。他们希望有一天能在培养皿里培养药物筛选和细胞治疗使用的组织。但CRISPR-Cas9的效果是永久性的，而Gersbach的团队需要瞬时打开和关闭组织特定位置的基因。他指出，形成血管都需要非常精密的控制，更复杂的生理过程对基因调控的要求更高。
Gersbach等人把失活的Cas9与基因激活分子、蓝光可激活的蛋白耦合起来。由此产生了一个光照时能激活基因表达，停止照射时，基因表达停止的基因操控系统。东京大学（University of Tokyo）的化学生物学家Moritoshi Sato也构建了一个类似的体系。该体系使用活性的Cas9，仅在蓝光照射下，Cas9才会切割DNA。
其他试验也通过把CRISPR与化学开关结合得到了各种不同的基因编辑系统。纽约威尔康奈尔医学院（Weill Cornell Medical College）的癌症遗传学家Lukas Dow，希望对成年大树癌症相关基因进行突变——复制一个与人类大肠癌相关的基因突变。他的团队设计了一个CRISPR–Cas9系统：一定剂量的复方多西环素能激活Cas9体系，使其切割目标基因。
这些工具都是研究者们实现精细基因组编辑的探索。Gersbach的团队尚未诱导血管生成，目前研究人员正致力于提高光控系统的效率。Gersbach表示，这只是第一代系统，后续还会不断改良。
CRISPR模型
癌症研究人员Wen Xue在他的博士后生涯里花费了数年培育出一种携带一种人类肝癌相关的突变的转基因鼠。他亦步亦趋地开展实验，学习基因编辑工具，将其注射到胚胎干细胞中，然后试图获得小鼠突变。为此，他一年花费了2万美元。他指出，这是研究疾病基因的限速步骤。
几年后，当他正要开始另一个转基因小鼠实验时，他的导师建议他使用CRISPR-Cas9工具。这一次，Xue订购了CRISPR-Cas9试剂盒，将其注入小鼠胚胎中，几周后就得到了想要的突变鼠。“我们一个月就得到了转基因鼠，”Xue说，“我真希望我能早点使用这个技术，那样我的博士后时间会大大缩短。”
从癌症到神经退行性疾病等领域的研究者们都以极大的热情，学习、使用CRISPR-Cas9来创造疾病动物模型。CRISPR系统缩短了转基因动物模型建立的时间，增加了基因调控的精细程度，并扩大了可编辑的物种范围。Xue现在在麻州大学医学院（University of Massachusetts Medical School）成立了自己的实验室，利用CRISPR-Cas9在细胞与动物突变模型上系统地筛选肿瘤基因组数据。
研究人员希望把多种新的CRISPR-Cas9技术融合起来，实现基因组和表观组的精细操控。Dow指出，这些系统的整合威力不容小觑。这可能帮助科学家们捕捉和理解人类疾病的复杂性。
以肿瘤为例，一个肿瘤可以包含几十个可能有助癌症发展的突变。Dow指出，对于建模，可能不需要关注这么多突变。但是建立恶性程度高、接近人类癌症真实情况的疾病模型，研究者可能需要在模型中引入2-4个突变。使用旧的基因编辑工具引入突变非常费时，而且成本极高。
2015年生物工程师Patrick Hsu 在加州萨克生物研究所（Salk Institute for Biological Studies）建立了自己的实验室。他计划利用基因编辑工具建立帕金森病和阿兹海默症等神经退行性疾病的细胞和狨猴模型。相比于小鼠模型，狨猴模型能更有效地模拟人类行为和疾病发展。如果使用旧的基因编辑工具，建立狨猴模型成本极高，且进展缓慢。
虽然Hsu设计实验，使用CRISPR-Cas9来编辑狨猴的基因，但他已经意识到，该工作可能只是下一步工作的垫脚石。他表示，技术会不断更新换代。研究者不能死守旧方法，应当时常思考哪些生物问题需要解决。
