ELISA双抗体夹心法
操作步骤
1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O•D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O•D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
1. 试剂
（1） 包被缓冲液（PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）:
Na2CO３ 1.59克
NaHCO３ 2.93克
加蒸馏水至1000ml
（2） 洗涤缓冲液（PH7.4 PBS）：0.15M
KH2PO4 0.2克
Na2HPO４•12H2O 2.9克
NaCl 8.0克
KCl 0.2克
Tween-20 0.05％ 0.5ml
加蒸馏水至1000ml
（3） 稀释液：
牛血清白蛋白（BSA） 0.1克
加洗涤缓冲液至100ml
或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。
（4） 终止液（2M H２SO４）：
蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。
（5） 底物缓冲液（PH5.0磷酸棗柠檬酸）:
0.2M Na２HPO４（28.4克／L） 25.7ml
0.1M 柠檬酸（19.2克／L） 24.3ml
加蒸馏水50ml。
TMB（四甲基联苯胺）使用液:
TMB（10mg／5ml无水乙醇） 0.5ml
底物缓冲液（PH5.5） 10ml
0.75％H２O２ 32μl
（7） ABTS使用液:
ABTS 0.5mg
底物缓冲液（PH5.5） 1ml
3％H２O２ 2μl
抗原、抗体和酶标记抗体。
（9） 正常人血清和阳性对照血清。
2.器材:
（1） 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
（2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
（3） 4℃冰箱，37℃孵育箱。
