聚丙烯酰胺凝胶电泳仪分析技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的电泳技术，于1959年建立，1964年进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于分辨率高，目前已广泛用于蛋白质等生物大分子的分析。
一、PAGE工作原理：
聚丙烯酰胺凝胶具有高粘度和高摩擦阻力，电泳过程中能防止对流，把扩散减到zui小。凝胶具有多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，能产生分子筛效应，其分离既与电荷密度有关，又与分子大小有关，对分离不同相对分子量的生物大分子极为有利。
二、PAGE载体特性：
采用聚丙烯酰胺凝胶作为载体的目是防止电泳过程中分子的对流和扩散，使待测组分得到更有效的分离。载体应具备以下特性：
1、物理化学性质稳定，在电泳过程中不受环境因素的影响，保持原有的状态和性能。
2、化学惰性，在电泳过程中不与缓冲液中的离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。
3、分布均匀，电渗小，结果重复性好。
三、聚丙烯酰胺凝胶合成方式：
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（CH2 = CH－CO－NH2，简称Acr）和交联剂N，N′－甲叉双丙烯酰胺（CH2 = CH－CO－NH－CO－CH = CH2，简称Bis）在催化剂作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成不带电荷且具有分子筛性质的三维网状结构凝胶。参与反应的催化剂有两种成分，一种是引发剂，提供原始自由基，通过自由基传递，使单体Acr成为自由基，引发聚合反应；另一种是加速剂，加快引发剂释放自由基的速度。
聚丙烯酰胺凝胶的合成是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原反应来完成，催化体系的实质是自由基催化的氧化还原过程。聚丙烯酰胺凝胶合成方式有化学聚合和光聚合。
1、化学聚合：
（1）原理：
引发剂过硫酸铵（AP）在加速剂N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（TEMED）的催化下形成游离氧自由基，即S2O82ˉ→ 2SO4ˉ，硫酸自由基的氧原子激活单体Acr形成单体长链，交联剂Bis将单体长链间连成三维网状结构。
Acr和Bis决定孔径大小，AP和TEMED决定聚合速度。
（2）影响化学聚合的因素：
1）引发剂和加速剂的浓度：
引发剂和加速剂的浓度小，聚合速度慢。浓度过大，易导致电泳时烧胶和区带畸变。
一般使聚合过程在40～60min内完成。
2）系统pH：
在碱性pH时，聚合速度快。在酸性条件时，同样浓度的溶液，聚合速度慢。
存在一个zui优pH，以获得zui优聚合结果。
3）温度：
温度高，聚合速度快。温度低，聚合速度慢。
低温聚合时，凝胶会变得脆而浑浊，重复性差。在25℃聚合的凝胶，较透明，有弹性。
4）分子氧：
分子氧能使AP分解，导致自由基淬灭，阻止多聚体链长的增加。
进行化学聚合时，反应液应与空气隔绝。
5）系统纯度：
有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃和一些金属等会抑制聚合反应，反应液和容器表面接触的一层不能形成凝胶。
某些化学物质可减慢聚合速度。
（3）应用：
PAGE的分离胶（小孔胶）是通过化学聚合法制备而成。
2、光聚合：
（1）原理：
引发剂核黄素在加速剂TEMED和光照条件下，分解成无色的还原型（无色核黄素），在少量O2条件下，还原型核黄素被O2再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。
（2）影响光聚合的因素：
1）需痕量氧原子存在，但过量的氧会阻止链长的增加。
2）核黄素用量少（4mg/100mL），生物样品不失活。
3）光源容易获取，改变光照量可控制聚合时间。光照量不易掌握，使凝胶孔径不稳定。
（3）应用：
光聚合的凝胶孔径大，适于制备PAGE的浓缩胶（大孔胶）。
四、聚丙烯酰胺凝胶性能指标：
1、性能指标：
聚丙烯酰胺凝胶性能指标有凝胶总浓度和交联度等。
（1）凝胶总浓度（T）：
凝胶总浓度表示凝胶溶液中单体和交联剂的总百分含量。
T = [（a + b）/m]×100%
式中：a为单体Acr的质量（g），b为交联剂Bis的质量（g），m为溶液的体积（mL）。
凝胶总浓度主要影响凝胶筛孔大小。凝胶平均孔径随着凝胶总浓度的增大而减小。
实验表明，凝胶筛孔的平均直径和凝胶总浓度的平方根成反比。即：
D＝kd/（T1/2）
式中：D为凝胶筛孔的平均直径，d为多聚体分子直径，k为常数。
凝胶总浓度可在3%～30%之间变化。凝胶总浓度过高，凝胶硬而脆，易破碎。凝胶总浓度过低，凝胶稀软，不易操作。
（2）交联度（C）：
交联度表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的百分含量。
C = [b/（a + b）]×100%
交联度决定凝胶筛孔的zui大直径。交联度过高，凝胶不透明，缺乏弹性。交联度过低，呈糊状。要获得透明而有合适机械强度的凝胶，单体用量高时，交联剂量应减少；单体用量低时，交联剂量应增大。
a和b的比例很重要，决定凝胶的物理性质。
当a/b＜10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色。
当a/b≈30且T = 3%时，凝胶富有弹性，完全透明。
当a/b≥100时，即使5%的凝胶也呈糊状。
当a＜2%和b＜0.5%时，凝胶不能聚合。
2、良好凝胶的经验公式：
在100mL溶液中，Acr（g）×Bis（g）≈1.3
zui常用凝胶的组成是T＝7%～7.5%，C＝2%～3%。
标准凝胶的组成是T＝7.2%，C＝2.6%，可较好分离蛋白质。
当分析未知样品时，常用标准凝胶或4%～10%的梯度凝胶试测，然后确定合适的凝胶总浓度。
3、凝胶总浓度和交联度与凝胶孔径的关系：
聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于凝胶总浓度和交联度。
凝胶总浓度和交联度与凝胶平均孔径的关系如下：
（1）凝胶总浓度为6.5%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为2.4nm
2）交联度为5%时，平均孔径为1.9nm
3）交联度为15%时，平均孔径为2.8nm
（2）凝胶总浓度为8%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为2.3nm
2）交联度为5%时，平均孔径为1.6nm
3）交联度为15%时，平均孔径为2.4nm
4）交联度为25%时，平均孔径为3.6nm
（3）凝胶总浓度为10%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为1.9nm
2）交联度为5%时，平均孔径为1.4nm
3）交联度为15%时，平均孔径为2nm
4）交联度为25%时，平均孔径为3nm
（4）凝胶总浓度为12%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为1.7nm
2）交联度为5%时，平均孔径为0.9nm
（5）凝胶总浓度为15%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为1.4nm
2）交联度为5%时，平均孔径为0.7nm
当凝胶总浓度＜2.5%时，可筛分相对分子量＞106的大分子。
当凝胶总浓度＞30%时，可筛分相对分子量＜2000的多肽。
当交联度为5%时，凝胶平均孔径在各凝胶总浓度时均zui小。
4、凝胶的分子筛效应：
凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，分子筛效应的大小取决于凝胶孔径大小与生物大分子大小的接近程度。凝胶总浓度不同，平均孔径不同，不同大小和形状的大分子通过筛孔时受到的阻力不同，加上大分子的电荷效应，使迁移率不同的大分子得以分离。
（1）蛋白质相对分子量与凝胶总浓度的关系：
1）蛋白质相对分子量范围：＜1×104
适用的凝胶总浓度：20%～30%
2）蛋白质相对分子量范围：1×104～4×104
适用的凝胶总浓度：15%～20%
3）蛋白质相对分子量范围：4×104～1×105
适用的凝胶总浓度：10%～15%
4）蛋白质相对分子量范围：1×105～5×105
适用的凝胶总浓度：5%～10%
5）蛋白质相对分子量范围：＞5×105
适用的凝胶总浓度：2%～5%
（2）核酸相对分子量与凝胶总浓度的关系：
1）核酸相对分子量范围：＜1×104
适用的凝胶总浓度：15%～20%
2）核酸相对分子量范围：1×104～1×105
适用的凝胶总浓度：5%～10%
3）核酸相对分子量范围：1×105～2×106
适用的凝胶总浓度：2%～2.6%
用于大分子核酸研究的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，凝胶太软，几乎是液体，不易操作，可加入0.5%琼脂糖或在3%凝胶中加入20%蔗糖，以增加机械强度而又不影响凝胶筛孔大小。
五、PAGE特点：
1、优点：
（1）凝胶孔径与生物大分子大小具有相似的数量级，具有良好的分子筛效应。
（2）根据待分离大分子的相对分子量，通过改变凝胶总浓度和交联度可调节凝胶孔径，使大分子得到较好分离。
（3）在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械强度好。
（4）凝胶是由－C－C－C－C－结合的酰胺类多聚物，侧链上具有不活泼的酰胺基，没有其它带电基团，无吸附，几乎无电渗作用。
（5）化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶，凝胶杂质少，不污染样品，与生物大分子不发生化学反应，样品分离后仍然保持生物活性。
（6）可按需要把带有一定电荷的基团作为共聚体渗入其中。
（7）电泳过程中对温度和
