激光共聚焦显微镜观察GFP定位
实验概要
本实验介绍了用激光共聚焦显微镜观察GFP在转基因植物中定位的技术。
实验步骤
1. 将构建好的目的基因与GFP(绿色荧光蛋白)的植物融合表达载体，通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥，获得转基因株系；
2. 获得的转基因株系制作切片:转基因株系植株的根尖用手术刀片切下，放入事先滴有磷酸缓冲液的载玻片上，再盖上盖玻片，制作根尖的临时压片，备用；
3. 将Zeiss LSM 510 Meta型激光共聚焦仪的电源和激光管的开关打开，并将与其相关的计算机打开；
4. 启动LSM 510 Meta软件，进入Start Expert Mode；
5. 在主菜单的Acquire选项下选择Laster，选择所需要的激光管。观察GFP荧光时，需打开氢离子激光(Argon ion )，包含458、477、488、514 nm四种波长。打开激光时先点Standby，等On选项变为激活状态是再点On。在此还可以调节激光的输出功率，一般新激光管设定为25-30即可；
6. 在Micro模式下选择所需要的物镜及相关的滤光片(需要观察什么颜色的荧光，就选该颜色的滤光片)，并在Vis激活的形式下在通过显微镜找到所要观察的物象，通过粗、细准焦螺旋将物象调节清楚，并将其移动到视野的中央；
7. 在Config模式下设置观察所需的光路。观察GFP荧光时，可直接在通道Channel模式下选择signal channel模式，并选择滤光片HFT488，发射光滤片设定为BP505-530，并在此处选择相应的伪彩(一般设定为绿色)。注意HFT需要和选择的激光波长相符。
8. 在S can模式下进行扫描参数的设置，这主要包括对Mode和Channel两种模式的设置。在Mode模式下，可以进行转换物镜、选择扫描分辨率、选择扫描速度、选择扫描平均、选择扫描范围、将扫描范围重置的设置。一般扫描速度越慢、扫描平均数越多，所得到的图片质量越好；在Channel模式下可以选择通道、调节Pinhole值、调节Gain值、调节背景、调节激光透过比例等。调节Pinhole首先选择1，预扫描后根据照片质量，再调节。Gain值在可以看到清楚物象的前提下，可以适当的小一些；
9. 设置完相应设置后，开始扫描图像。首先切换到Lsm状态下，此时无法通过显微镜观察。新开一个文件窗口，通过快速扫描并可以适当调节细准焦螺旋调节清楚物象，后通过调节Mode和Channel模式下的相关参数，以获得质量较高的图片。将得到的图片保存备用。
