流式细胞术的工作原理与发展综述
摘要：流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。是一项多学科交叉研究的结晶。流式细胞术及流式细胞仪的出现融合了医学，计算机学，物理学等众多学科背景。。它不仅测量速度快、准确度好、灵敏度高，而且还具有客观、直接和测量参数多的优点。目前，该技术已普遍应用于肿瘤学、血液学、免疫学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等领域。本文针对其发展历史及当前应用作一综述。
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 从其发明到如今在临床和实验室的广泛应用，每一步都凝结了电子技术、流体力学、计算机科学、激光技术、生物学、生物技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识。
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。因其在量上的准确性及其在质上的特异性，流式细胞术在药学，肿瘤学、血液学、免疫学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学，生物材料等众多研究领域得到了广泛的应用也取得了长足的进步。
1. 流式细胞术的工作原理
流式细胞术的基本原理和方法是将待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后，制成样品悬液，排成单列的样品经流动室的喷嘴喷出成为样品液流，与激光束相交时，样品被激发产生荧光，荧光检测器为光电倍增管，同时还可以光电二极管检测与样品大小有关的散射光，而散射光又分为前向散射光（FS）与侧向散射光（SS）（详见后述）测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。流式细胞术对细胞的分析要基于流式细胞仪才能实现。
流式细胞仪的基本结构分为三部分——液流系统，光学系统，数据处理系统。
首先待测细胞或微粒进入液流系统，待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液(又称鞘液)在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流束(即鞘流)，待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。（如下图）
继而液流进入光学系统，液流通过测量区的细胞被激发而产生荧光，在与入射光束和液柱垂直方向放置光学系统(透镜光栏、滤片、检测器)用以收集信号（如下图）
细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，（如下图）
主要分为前向散射光和侧向散射光。（前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。）。这些荧光信号的强度代表所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机采集所测量到的各种信号进行计算处理,将分析结果显示在计算机屏幕上,也可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上,以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同而有多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达,其x轴为测量的散射光或荧光的强度(可以是线性轴,也可以选择对数轴),纵轴为相对细胞数。一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有256或1024通道数,这视其模/数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的散点图、等高线图或三维的立体视图等。由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。（分选原理如上图5）
2. 流式细胞术的发展历史
流式细胞术是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪。具体发展历程如下[1]：
1930年,Casperrsson和Thorell开始致力于细胞的计数;
1934年,Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人,他试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量;
1936年,Caspersson等引入显微光度术;
1940年,Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白;
1947年,Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器;
1949年,Coulter提出在悬液中计数粒子的方法并获得ZL;
1950年,Caspersson用显微分光光度计在紫外(UV)和可见光光谱区检测细胞;
1953年,Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功地设计红细胞光学自动计数器;
1953年,Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形;
1954年,Beirne和Hutchcon发明光电粒子计数器; 1959年,B型Coulter计数器问世;
1965年,Kamemtsky等提出两个设想:(1）用分光光度计定量细胞成分;(2)结合测量值对细胞进行分类;
1967年,Kamemtsky和在.Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法;
1969年,Van Dilla Fulwyler及其同事们在LosALmos,NM(现在的National Flow Cytometry Resource Labs)发明第一台荧光检测细胞计;
1972年,Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;
1975年,Kochler和Milstein提出单克隆抗体技术,为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础。
3. 流式细胞术的应用
3.1流式细胞术在医学中的应用
3.1.1流式细胞术在肿瘤学中的应用[2]
癌细胞与正常体细胞最明显的区别就是细胞DNA含量发生改变或形态异常，以及细胞生长周期的改变。利用FCM进行细胞周期分析、DNA倍体分析、定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等,从而获得组织形态学方法难以得到的信息,可为肿瘤的临床诊断、治疗和预防提供帮助。
3.1.2流式细胞术在血液学中的应用
血液中的细胞在发育过程中细胞表面表达出不同的抗原，利用特有的荧光标记可以检测其荧光强度判断血细胞发育生长正常与否，尤其在急性白血病的诊断中，利用不同类型白细胞表面表达出的抗原种类及量的不同，流式细胞术能够较为客观地诊断急性白血病及其分型，也能够检测出骨髓正常细胞中万分之一的白血病细胞，进行微小残留病的检测。此外，在造血干细胞移植后，需使用流式细胞术监测移植患者免疫重建的状况，如淋巴细胞亚群分析。流式细胞术在治疗关于血小板减少的疾病[3]中也起到了重要作用。外周血小板减少的病因主要有: ( 1) 骨髓造血功能障碍; ( 2) 血小板破坏过多; ( 3) 储存池异常。网织血小板检测能够较好地区分血小板减少的病因。网织血小板内部含有残存的 RNA，噻唑橙( TO) 可与血小板内的 RNA 结合，发出绿色荧光。其荧光强度与 RNA 含量正相关。由此，可以检测网织血小板的百分含量。骨髓造血机能障碍引起的血小板减少( 再生障碍性贫血) ，网织血小板下降; 免疫性血小板破坏增加导致的血小板减少( 特发性血小板减少性紫癜) 网织血小板上升[4]也可以用流式细胞术检测血小板相关免疫球蛋白来确定免疫性血小板减少[5]。进一步可以检测 血小板释放的微粒( platelet microparticles，PMPs) ，分析血小板功能。
3.1.3流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术中对随着单克隆抗体技术、荧光色素化学等技术的发展,流式细胞术成为当代技术的“杂交体”。正像免疫学作为一种不断发展的学科和技术手段延伸到生物、医学及其他领域一样,流式细胞术也以它的快速、灵活和定量的特点,广泛地被应用于免疫理论研究临床实践应用的各方面,所以有人称之为现代免疫技术基石之一。尤其同单克隆抗体结合应用,在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监督、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面都起着相当重要的作用。[6]
3.2流式细胞术在药学中的应用[7]
流式细胞术作为一种在细胞、受体及分子水平的定量分析方法,在药物滥用，多药耐药基因，体外药敏实验的研究中已成为一种非常重要的手段。例如：传统的药物敏感试验的方法包括试管肉汤稀释法和琼脂稀释法,以及纸片扩散法、微量稀释法和E-试验等。此等方法忽略细胞个体间的异质性,通常仅提供群体细胞的均值,且费时费力。将流式细胞术应用于细菌药试验,用荧光探针来标记细菌细胞的特征,通过仪器测定药物对细菌个体生长的影响,可以检测到群体中具有异质性的菌细胞,因此较其他方法更为准确、敏感和快速。在国外FCM甚至已被建议作为细菌常规药敏试验[8]。再如流式细胞术在肿瘤学的基础和临床研究中都已有很成熟的应用;药物与肿瘤的关系也有报道,如:刘屏[9]等用流式细胞仪观察了吗啡依赖小鼠T淋巴细胞周期的变化情况,发现胸腺细胞的DNA合成期和增殖分裂期均受到抑制。
3.3应用流式细胞术应注意的问题
3.3.1荧光检测[10]
实验过程中，流式细胞仪所检测到的荧光信号主要包括三部分: ( 1) 细胞自发荧光。来自于细胞代谢过程中的自发荧光的分子，如核黄素、细胞色素等，其含量越高，自发荧光越强; ( 2) 非特异性结合。标记荧光素的抗体，除了与细胞表面的抗原特异性结合外，其 Fc 段也可与细胞表面 Fc受体结合，以及抗体蛋白与细胞蛋白质之间的吸附作用; ( 3) 特异性结合。这是单克隆抗体与细胞抗原的特异性结合。前两种荧光为实验“噪音”，后一种荧光是我们需要的信号。为了得到正确的检验结果，必须排除前两种荧光的干扰。主要方法是以同型对照为参照，来确定检测细胞是否表达相应抗原。需要强调的是不同细胞自发荧光强度不同，在外周血里面，单核细胞自发荧光最强，粒细胞次之，淋巴细胞最弱，培养的细胞自发荧光更强。
3.3.2正确设门
得到实验结果后，先正确设门才能进行有意义的分析比较，例如下图6中的实验结果，若在103处设门，则实验比较不出结果。
3.3.3荧光补偿
多色流式细胞术分析，各种荧光颜色之间会相互干扰，需要用补偿减去干扰的光源。不同荧光素发出的荧光，以及荧光的强弱都影响补偿值，也与仪器的滤光片狭缝有关。做补偿调节的原则，应以“横平竖直”为准。不同仪器、不同细胞、不同厂家试剂，其补偿值各不相同。如何做好荧光补偿调节，是流式细胞分析操作的难点，尤其在检测弱抗原表达时候，会直接影响检测结果。
4. 流式细胞术新技术[11]
4.1液相芯片技术
生物芯片技术是近年来随着人类基因组计划和蛋白质组计划的进展在生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术,现已被大家所熟知。将生物芯片技术和FCM有机结合在一起,把不同生物探针(核酸、蛋白等)标记在各种有荧光的微球上,以荧光标记微球作为反应载体在液相系统中完成生物学反应,即为流式细胞术液相芯片技术。它组成由微球体+探针+目的分子+报告分子的一种简单反应模式。可以在同一液相中同时检测多个目的分子。如对血液中多种白细胞介素检测。
4.2定量流式细胞分析
定量流式细胞分析(quantitative flow cytometry QFCM)是指用流式细胞术对细胞或微粒上标记荧光分子的定量分析,从而对细胞的生物分子进行精确测量。如每个分子表达的平均分子数、抗原数等。定量流式细胞分析不同于以往的相对荧光强度或阳性细胞百分率测量,它更为准确、灵敏。为FCM的发展趋势。如在获得性免疫缺陷综合症和“非典”的研究与治中,对外周血中的CD4+ T淋巴细胞进行绝对记数,来反映病情进展及监测疗效。
5. 小结
本文只是简要介绍了一些关于流式细胞术的应用，其应用范围远远不止这些，在多学科的交叉发展下，流式细胞术会有更广阔的发展空间和应用范围。
参考文献：
[1] [6] [10] [11]魏熙胤,牛瑞芳. 流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展[J]. 现代仪器,2006,04:8-11
[2] 陈丽. 流式细胞术在医学检验中的研究进展[J]. 右江民族医学院学报,2016,03:335-337.
[3] 陈军浩. 流式细胞术在临床及科研中的应用[J]. 临床检验杂志,2012,10:861-864
[4]宁宇，连小珂，王留兴． 流式细胞学细胞周期分析预测晚期食管癌化疗疗效［J］． 胃肠病学和肝病学杂志，2006，15( 2) : 144-146．
[5]尹亚飞，罗自勉，周新伏，等． 血小板相关抗体在特发性血小板减少性紫癜诊治中的临床意义［J］． 临床医学，2012，32( 1) : 4-5．
[7]周蓓,黄淑霞,周红霞. 流式细胞术在药学研究中的应用[J]. 中国医院药学杂志,2006,03:326-328.
[8]Steen HB.Flow cytometry of bacteria:glimpses form the past with a view to the future[ J].J Microbiol Methods,2000,42(1):65274.
[9]郑国强,刘叙仪,韩复生,等.阿霉素耐药性研究与流式细胞分析[J].中国肺癌杂志,2002,5(1):28-30.
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