ECL Plus超敏发光液使用方法
1、常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。注意用 HRP 标记 IgG 或用一抗-链亲和素 -生物素-HRP 夹心法。核酸杂交膜用 HRP 标记探针杂交，洗膜。
2、在洗涤膜上的 HRP 标记二抗的同时，新鲜配制发光工作液：分别取等体积的溶液 A 和 B 混合，放 置使之恢复室温否则会减弱荧光强度。建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有减低。
3、用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入并与发光工作液充分接触（约 0.125ml 发光工作液/cm2 膜）。室温孵育 3 分钟后立即压片曝光。孵育时间过长不会增加灵敏度，有时还会 导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应，使用过少的发光工作液不利于反应进行，也会导致膜上 条带曝光不均匀和灵敏度明显降低。为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。
4、用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。
5、在 X 光胶片暗盒内面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将杂交膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包 裹杂交膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖 杂交膜的保鲜膜固定在暗盒内，推荐蛋白带面向上。
6、在黑暗中放入 X 感光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显影冲洗。
ECL Plus超敏发光液注意事项：
1、步骤 1-5 可在日光灯下操作；但发光液暴露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作 可避免。戴手套可以避免在膜上留下手印，保持膜的洁净。
2、长时间曝光或蛋白质过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。 3、发光工作液孵育约 3 分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光 较弱，肉眼虽不可见但能使 X 胶片曝光。不能单凭肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上 可持续数小时并使 X 胶片感光，因而弱带可曝光 1-10 小时。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜， 重新孵育二抗，然后重新用 ECL 发光和曝光。
4、由于超敏发光液的高灵敏度，强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗 1：1000-1：4000，二抗 1：
2000-1：5000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带，导致失败！
5、某些市售保鲜膜包裹印迹膜时会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜，例如“克林莱”牌保鲜膜。
6、使用肉眼可见的预染色蛋白 Marker 和荧光-放射自显影曝光标签可帮助确定胶片上条带的准确位置 和大小。
7、NaN3 能抑制 HRP 活性，回收二抗时应避免使用 NaN3，如必需使用勿超过 0.01%。
