部分分解多肽两端有关的 PCR 法筛选 PK-120 基因实验

实验方法原理

实验材料 PK-120

试剂、试剂盒 Sephadex-50Gene Amp RNA PCR 试剂盒合成寡聚核苷酸抽提液酵母 tRNA

仪器、耗材 PCR 扩增仪

实验步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」

1. 引物设计

PK-120 部分分解多肽氨基酸序列中，最长序列 K-15，16 为引物设计的依据：

1.1 考虑全部编码的组合，

1.2 考虑人编码的使用频率，设计 PCR 引物，正义链及反义链如用这些引物获得的 PCR 产物当中，50 bp 的产物为目的 cDNA。

2. PCR 扩增

从肝脏来源的 poly（A）+ RNA 中，用 Gene Amp RNA PCR 试剂盒如以下所述，合成 cDNA 0.1ug 的 poly（A）+ RNA 中，加入 5 mmol/L MgCl2：

1×PCR 缓冲液Ⅱ，

2 mmol/L dNTPs，

1u 的 RNase inhibitor，

2.5 umol/L random hexamers

2.5 u 反转录酶，

混匀，总体积为 20 ul。

在 PCR 扩增仪上反应，PCR 参数为 ：

25℃ 10 min，

42℃ 30 min，

99℃ 5 min，

25℃ 5 min ，

第 1 循环反应，合成 cDNA。

在反应液中再分别加终浓度为 2 mol/L MgCl2，1×PCR 缓冲液Ⅱ，加 1nmol 3' 引物 5' 引物。混合，总体积为 100 ul。

94℃ 3 min 1 循环。

94℃ 1 min，

37℃～42℃，2 min，

72℃， 2 min，

40 循环。

72℃， 7 min，1 循环。

3. 凝胶电泳及提取 DNA

纯化 PCR 产物后，在 0.25×TBE 溶液中，进行 10％ 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分子量标准使用限制性酶 Msp1 消化的质粒 pBR322。电泳结束后，凝胶经溴化乙锭染色，紫外照射，观察到 50 bp 的 PCR 产物。将这 50 bp 的条带切下，在抽提液中，室温放置过夜之后 1200 r/min 4℃ 离心 10 min，回收上清。反复操作两次，用乙醇沉淀 2 次，用 TE 液溶解，上样 Sephadex-50 柱，再用乙醇沉淀洗脱组分，沉淀悬浮于 TE 溶液中。

4. 测定碱基序列

抽取提出的 PCR 产物用 PCRⅡ载体亚克隆，测定碱基序列。其结果以肝脏 poly mRNA 为模板，据引物 S15-i 和 A15-i 扩增的 50 bp 的 PCR 产物序列，和从氨基酸序列预测的碱基序列完全一致。表明这是编码母的部分分解多肽的 cDNA。

注意事项

其他

试剂：

Sephadex-50

Gene Amp RNA PCR 试剂盒

合成寡聚核苷酸用 BIO-SYNTHESIS，INC 公司产品合成寡聚核苷酸

抽提液

750 mmol/L 醋酸铵-10 mmol/L 醋酸镁-0.1 mmol/L EDTA-0.1％SDS-1％TE 饱和酚

25ug/ml 酵母 tRNA

其他他试剂均为市售