：促红细胞生成素中电荷异质体的测定

　　背景介绍

　　 促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)是一种糖蛋白，绝大部分由肾脏产生，主要功能是促进红细胞的生成，提高机体血红蛋白的浓度，临床上主要用于治疗肾性贫血和肿瘤等各种慢性疾病所伴发的贫血。近年来研究发现，EPOR还广泛表达于人体内的非造血组织，它们与EPO结合发挥器官保护、免疫调理、抗炎等多种非造血作用，所以EPO被认为是一种多效性作用的细胞因子。EPO是迄今所知作用最单一且安全可靠的升血红蛋白制剂。EPO的应用能有效改善肾性贫血患者生活质量，减少输血次数，甚至不输血，降低心血管等并发症的发生率。

　　EPO分子骨架为165个氨基酸组成的肽链，具有3个N端连接的糖基化位点和1个O端连接的糖基化位点，糖链占蛋白总分子质量的40％，是一种高度糖基化的蛋白。唾液酸分布于糖链末端，作为EPO的主要活性成分之一，唾液酸含量的多少对EPO体内生物学活性的高低起决定性作用。EPO蛋白唾液酸化修饰程度的差异会导致所带电荷的差异，EPO蛋白不同唾液酸化修饰组分的分析检测也就是对其不同电荷异质体组分的分析检测。

　　 传统电荷异质体的分析手段主要依靠平板等电聚焦电泳(IEF)，通过等电点差异对电荷异质体进行分离，唾液酸化程度较高的组分相对等电点较低。然而这种方法只能对不同组分进行定性分析，难以对各个组分的相对百分含量进行分析，使用范围十分局限。随着蛋白分析手段的不断进步和发展，基于毛细管电泳分析技术的毛细管区带电泳(CZE)以其快速、高效、准确的分析特点逐步被应用于蛋白的电荷异质体分析。

　　本方法主要采用CAPEL-205高效毛细管电泳仪，基于毛细管区带电泳(CZE)检测技术进行EPO蛋白不同唾液酸化程度的电荷异质体的检测，参照的是欧洲药典1316(Identification, method B. Capillary zone electrophoresis) 中的方法。

　　测试条件

　　BGE：按照欧洲药典1316的条件

　　毛细管电泳: Leff/ Ltot = 102/112 cm，ID= 50 µm

　　样品进样: 1000 mbar ，5s

　　电压: +16 kV

　　温度: 35℃

　　 检测波长: 214nm

　　 样品: 用于物理化学测试的促红细胞生成素的电荷异质体

　　 CRS 1-8-EPO

　　图1 检测色谱图

　　结论

　　 采用CAPEL-205高效毛细管电泳仪，基于毛细管区带电泳(CZE)检测技术进行EPO蛋白不同唾液酸化程度的电荷异质体的检测，可以实现EPD电荷异质体的有效分离，方法准确、灵敏度高、重现性好，可以满足药品实验室日常分析及研究要求。

　　配置列表

　　仪器配置

　　CAPEL-205毛细管电泳系统，装有WINDOWS®XP/ 7/8/10操作系统的笔记本电脑

　　ELFORUN专用软件工作站

　　Capel-205M.jpg

　　Capel-205毛细管电泳仪的优势特点

　　通过施加高压电场，基于毛细管液体样本组成成分迁移速度的差别。应用UV吸收检测技术，在毛细管出口应用高精度光学系统定量检测分离出的组分

　　光源：高强度氘灯，优化光学设计保证低检出限

　　可实现多种不同分析方法和分离模式，毛细管区带电泳，毛细管胶束电动色谱，毛细管等电聚集，毛细管凝胶电泳，毛细管等速电泳

　　全自动进样，进样方式可选电动及压力进样。压力进样，步进值1mbar，最高99mbar；电动进样，电压范围：步进值1kV，1-25kV可调

　　毛细管冷却：恒温水冷系统，环境温度5-50℃可调；恒温水冷保证温度控制更加精细和准确，提高分析效果（相对与风冷，冷却效果更优/与液冷相比，成本更低）

　　标准离心管1.5mL(Eppendorf型)适用于所有样本分析

　　扩展的全自动进样器，高达59个进样位，允许提供自动过夜分析功能

　　独特全自动开口进样设计，避免挥发和交叉污染

　　新型高压模块提供±30kV压力，保证超优的分析效率和快速分析时间

　　采用流动电位控制技术，极大提高重现性，尤其是分析复杂样品更具优势