T载体克隆的DNA序列分析
实验目的：
了解常规DNA序列分析技术（Sanger双脱氧法）的原理及操作步骤。
实验原理：
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学降解法。两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。
Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE
ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是社会上提供DNA测序服务的生物技术公司中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI
PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
310型基因分析仪（即DNA测序仪），采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司ZL的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR
测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled
device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶（POP
6）和GeneScan胶（POP
4）。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。
由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
实验材料：
1、客户端：
测序模板：可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。
A.含待测质粒DNA的菌液：细菌繁殖和质粒DNA抽提工作交给公司做。
B.或已提纯的质粒DNA：客户自己完成质粒DNA抽提工作。
C.或菌落PCR扩增产物：将待测序的DNA片段用PCR扩增出来，作为提交给公司的模板。
测序引物：需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
本实验中使用GAPDH PCR扩增引物F2和R2：同实验3。
2、公司端：
[1].BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PEZL四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。
[2].pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。
[3].M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。
[4].DNA测序模板：可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。
[5].引物：需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
[6].灭菌去离子水或三蒸水。
[7].0.2ml或和0.5ml的PCR管：盖体分离，PE公司产品。
[8].3mol/L 醋酸钠(pH5.2)：称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。
[9].70%乙醇和无水乙醇。
[10].NaAc/乙醇混合液：取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。
[11].POP 6测序胶：ABI产品
[12].模板抑制试剂(TSR)：ABI产品
[13].10×电泳缓冲液：ABI产品
[14].ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪
[15].2400型或9600型PCR仪
[16].台式冷冻高速离心机
[17].台式高速离心机或袖珍离心机
操作步骤：
1、PCR测序反应
[1].取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：
总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
[2].将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96 10s℃，50 5s℃，604min℃，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
2、 醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
[1].将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
[2].加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
[3].加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3、电泳前测序PCR产物的处理。
[1].加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
[2].将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。
[3].在PCR仪上进行热变性(95 2min)℃，冰中骤冷，待上机。
4、上机操作
[1].按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。
[2].仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。
[3].
电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。
[4].
电泳结束后仪器自动分析或打印出彩色测序图谱。
5、序列分析：
仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6、测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
[1].
测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%
[2].
差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。
7、向客户提供报告
测序报告通常为一份大约650bp的彩色图谱和一份大约800bp的序列。
注意事项：
[1].ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。
[2].本实验测序PCR反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4～4.5μl，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。
[3].作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30～90ng，单链DNA需50～100ng，双链DNA需200～500ng，DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6～2.0，最好用去离子水或三蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。
[4].本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA长度为650bp左右。
[5].本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5) %，仪器不能辨读的碱基N＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。
[6].为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。
[7].对于N碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。
[8].为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。
