毛细管电泳―ICP-MS法测定藻类中3种不同形态的铅化合物
铅是一种重金属，有毒，在所有已知毒性物质中，铅分布广泛，书上记载最多的是铅。铅对人体的毒害是积累性的，能够在生物体内蓄积且排除缓慢，人体吸入的铅25%沉积在肺里，部分通过水的溶解作用进入血液，是生物半衰期长且具有高毒性的重金属环境污染物[1]。人类可以通过食物链摄取铅，也能从被污染的空气中摄取铅，铅过量对人体
多个系统造成损伤，具有一定致突变和致癌性，对儿童的危害更大[2-3]，目前认为有机铅化合物的毒性大于无机铅化合物，其毒性是无机铅的10～100倍[4-5]。有报道[6]认为四乙基铅和三乙基铅对人体的毒性最强，藻类作为自养生物需从环境中吸取足够的无机盐，来进行同化作用，藻类对铅有很强的富集作用 [7]。由于铅不易代谢和降解，当藻类从海洋环境中吸收铅，会在体内发生积累，通过食物链的逐级浓缩，最终将重金属铅传递进入人体。 目前研究多尝试将高效液相色谱（HPLC）、离子色谱（IC）等现代分离技术，与原子荧光光谱（AFS）或电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等元素选择性检测仪器结合来测定不同化合物形态[8-12]，但多存在操作复杂、分析时间长、准确性或灵敏度低等问题[13]。而毛细管电泳（CE）有高分离效率、分析速度快、消耗样品少等优点[14]，联合ICP-MS元素选择性检测，具有元素选择性、灵敏度高、干扰小等优点，两者联用为强有力的元素形态分析工具[15-17]。本实验运用CE-ICP-MS联用技术建立贝类海产品中重金属铅的形态分析方法，利用该方法测定紫菜和海带等藻类海产品中铅的形态[18]，以期为海产品安全食用提供科学依据，保障人类的生命健康。
1 试剂和仪器
1.1 部分试剂
氯化三甲基铅（TML）和氯化三乙基铅（TEL）（德国，Dr.Ehrenstorfer公司）；氯化铅（Pb（II））（美国，Strem Chemicials公司）；EDTA（华盛化工试剂公司）、CTAB（美国，Sigma公司）；液氩（纯度99.999%）；实验用水均为MIlli-Q超纯水（18.2 M?）；10mg/L Li、Co、Y、Tl和Ce的调谐溶液（Agilent公司）等。
1.2 部分仪器
电感耦合等离子体质谱（美国，ICP-MS，Agilent 7500a）；毛细管电泳仪（中国，Reeko公司，CEi-SP20）；MARS密闭微波消解仪（美国，CEM公司）；MAS-II常压微波合成萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；实验室pH计（上海，梅特勒-托利多仪器有限公司，FE20）；氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司，TTL-DC）；Milli-Q超纯水处理系统（美国，Milipore公司，18.2MΩ）；AL104 型电子天平（瑞士，Mettler-Toledo公司）等。
2 实验方法
2.1 前处理方法
采集到的新鲜海苔、海带和紫菜等样品，取其可食部分洗净，利用悬臂搅拌器匀浆，匀浆样品放入-20℃冰箱中冷冻过夜后，采用真空干燥机冷冻干燥，并粉碎过0.2mm筛，密封保存备用。
2.1.1 总铅的前处理测定方法 根据参考文献[19]，按其消解程序进行微波消解，利用ICP-MS测定样品中重金属铅的含量。
2.1.2 有机铅及无机铅的提取方法 根据参考文献[19]，进行有机铅及无机铅的提取。
2.2 测定条件
等离子体气流速：15.0L/min；辅助气流速：1.0L/min；载气流速：1.2L/min；采样锥：铂锥；采样深度：7.6mm；雾化室温度2.0℃；质量数As；积分时间：1.0s；ICP-MS条件：射频功率1350W；分析测试前，用10μg/L 的 7Li，89Y，205Tl，140Ce的调谐液对ICP-MS进行调谐，使仪器达到分析测定要求。
CE条件：分离电压：-13kV；缓冲溶液：H3BO3- 70mmol/L，Na2B4O7（pH 8.90）17.5mmol/L；泵速：100mL/min；电动进样：进样时间为12s；分离时间：20min。每次测试前及每两次进样之间，均冲洗毛细管。所有溶液进样之前，均需用0.45μm滤膜过滤。
2.3 标准系列浓度
分别用超纯水配制成浓度为15、25、50、100、200ng/mL的混合标准溶液系列，超纯水作为标准空白。在优化的实验条件下，采集空白及标准溶液系列。采用等离子体色谱软件绘制校准曲线并计算各色谱峰的积分面积。
3 结果
3.1 缓冲液pH值的优化
当pH>9.10时，Pb（II）、TML与TEL三种不同形态铅化合物虽能分离，但TML与TEL的分离效果较差，当pH<9.00时，其可以实现基线分离；当pH=8.90时，其分离效果、灵敏度、迁移时间均较理想；当pH<8.90时，虽其均能完全分离，但各峰迁移时间延长。随pH值的减小，TML与TEL两种不同形态铅化合物迁移时间显著延长，综合考虑分离度和迁移时间，选择pH=8.90为本实验最佳pH值。见图1。
3.2 铅形态标准曲线及检出限
为了获取标准工作曲线， 在最适CE-ICP-MS条件下，测定（15，20，25，50，100和200ng/mL）的混合标准溶液，在15～200ng/mL的浓度范围内，三种形态铅化合物的信号强度（以峰面积记）与浓度之间的线性相关系数均优于0.911（见表2）。经计算，在连续进样模式下，被分析物Pb（II）、TML和TEL的CE-ICP-MS仪器检出限（3S/N）以铅计分别为0.092，0.025和 0.026ng/mL。见图2。
3.3 稳定性实验
在最适CE-ICP-MS条件下，为了验证本研究方法的重现性，相同实验重复做5次。三种形态铅化合物Pb（II）、TML和TEL迁移时间的RSD（相对标准偏差）小于4%，峰面积的RSD小于5%。分别对紫菜和海带两种样品进行连续进样25μg/L的铅标准溶液，将所得的砷化合物面积积分，5次平行测得紫菜样品中峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为Pb（II）4%，TML5%和 TEL5%；海带样品中相对标准偏差（RSD）分别为Pb（II）4%、TML3%和 TEL5%。表明重现性良好。
3.4 加标回收率及样品的提取率
紫菜和海带两种藻类植物的各形态铅化合物的测定结果见表3、4，其毛细管电泳谱图见图3、4，并进行了加标回收率实验。各种形态铅化合物含量的总和与总铅量测定基本一致。从表3 和图3中发现两藻类样品中都只检测到一种铅化合物Pb（II），其干重3.003μgPb/g（干重）和2.525μgPb/g（干重）。5次测定的平均加标回收率分别为91%～93%、91%～104%，RSD<5%。 从紫菜和海带样品的检测结果来看，海藻中主要的铅形态是无机铅Pb（II），基本不含有有机铅形态TML和 TEL，有研究表明藻类中较少存在，而藻类细胞壁上含有大量与无机铅Pb（II）结合的官能团，可与无机铅Pb（II）充分接触并吸收[20]。实验也说明藻类可能更容易积累无机铅化合物。
4 讨论
建立了CE-ICP-MS同时测定Pb（II）、TML和 TEL三种形态铅化合物的方法，提取方法有效，在保证铅形态不变的前提下，能够简单、高效地从藻类样品中提取不同形态铅化合物，样品消耗量少，回收率较好。利用该分析方法，在20min内成功对市售紫菜和海带等藻类进行了测定，回收率在91%～104%之间，RSD（n=5）<5%。根据检测结果发现，在紫菜和海带样品都只检测到无机铅Pb（II）一种形态铅化合物，在不计紫菜中测得的未知铅化合物情况下，紫菜和海带样品中三种铅化合物Pb（II）、TML和 TEL三的提取效率分别为61.5%和83.3%，说明该方法具有较高的准确性与可靠性。运用该方法测定藻类植物中不同形态铅化合物，为海产品健康评估提供了一种实用的方法，为海产品的质量控制提供了科学的技术支撑。
