RNA 萃取实验前必读 成功经验法则大公开
Lab 的经验和客户的难题
以华联基因体实验室的长期以来承接客户 RNA 检体的经验来说，我们经常遇到的问题：
（1）RNA 的总量不够；
（2）RNA 有严重的盐类污染；
（3）RNA 有严重的有机溶剂污染；
（4）DNA 污染；
（5）样品降解严重。前四项问题都还好解决，只需要再次萃取或进行纯化即可解决，但是样品降解就较为棘手，常常因重新准备检体一来一往， 耗掉不少心力和时间，最后也拿不到好的结果。
客户经常会问为什么执行芯片实验会如此要求RNA 质量呢? 而其他的检测方法如实时定量聚合连锁反应（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR）却不需要?
回答这个问题前就要从实验的原理说起，简单
的讲 Q-PCR 的检测原理是针对要检测的基因，设计一对基因特异性的引子，透过反转录反应（RT）配合PCR
的放大方式和及时侦测放大的产物量，藉以回推原始的RNA 含量；而RT的方式主要是采用随机引子（Random_primer）、进行互补DNA
(cDNA)的翻制，因此即便RNA有些微裂解，作为模板的RNA也可以忠实的被翻制成cDNA。
但是芯片实验进行，主要是以放大和讯息RNA(mRNA)完全配对的互补RNA(cRNA)，再进行杂合反应，此步骤必须利用poly(dT)- T7启动子序列和讯息RNA的poly(A)结合后，将T7启动子序 列连带的镶入反转录的cDNA的5端，再经由T7启动子驱动试管内反转录反应，生合成反股的cRNA ，再进行后续的芯片杂交的实验。可想而知，如果RNA有降解严重的现象，表示许多mRNA并不能忠实的被放大因此会产生许多伪阴性的结果。 至
此读者心中可能就有一个概念了，假设Q-PCR
和芯片被应用在瞎子摸象的故事情节中，用Q-PCR的人只要能摸到大象的耳朵就可以说这里有大象，透过计算耳朵的数量就可以计算大象的数量；但是用芯片实验方法的人，必须先确认所摸到的个体具备大象的完整特征，才能确确实实的说这里有一只大象。这也就说明了为何芯片实验会如此要求RNA的质量。
 | 图一、电泳分析之RNA质量状态，显示质量良好之总RNA(lane 1, 9, 10)，部分裂解以及严重裂解之总RNA(lane 8 与 lane 6 and 7)，具有DNA 污染之总RNA (lane 4 and 5)以及仅gDNA核酸 (lane 2 and 3) 。 |
 | 图二、吸光值图谱分析，02B检体在230及280分别有高的吸光值，显示分别有盐类 别有高的吸光值，显示分别有盐类(OD230)及有机溶剂(OD280)污染。 |
RNA 萃取的方法有哪些？
除了传统的纯化方法，如 LiCl 沉淀等外，因应 RNA 研究的庞大需求，目前市面上已有许多琳琅满目的 RNA 萃取套组，供给不同萃取需求目的之研究，而这些产品的设计原理不外乎是利用有机溶剂进行分层萃取如：
（1）phenol-chloroform或利用RNA 于酒精中呈现疏水性的特性，进行吸附分离；
（2）吸附性管柱（Silica column）。一般而 言，只要有正确的RNA 操作观念配合正确的步骤，大致上都可以萃取出质量不错的 RNA，但是不同的萃取方法所取得的 RNA 组成分布会有所不同，因此建议要根据所要分析的对象 RNA，选择正确的萃取方法或套组，例如：如果要研究小 RNA 的表现就不可选择以 mRNA 为萃取对象的方法。
此外，内源核醣核酸分解酶（RNase）含量高的样品，建议使用含 phenol-chloroform 的裂解液，以增加去除酶活性的能力。以下就以 TRIzol 的操作步骤为例，来跟读者分享RNA 萃取步骤中应注意事项及改善萃取 RNA 值与量的方法。
器具如何清洁？
RNA 萃取过程中，会面临的最大的敌人就是 RNase，RNase 是一个非常顽强的 RNA 分解酶， 它几乎无所不在，在我们所处的环境中、身体表面甚至细胞内就有内源性的 RNase 存在。
RNase 展现活性时不需要辅酶（coenzyme）或辅因子（cofactor），在变性溶液的环境下虽然会失去活性，但是当去除变性物质后，仍然会展现些许活性，甚至在低浓度的 SDS 溶液中仍具有活性，因此能做到有效杜绝去除 RNase 的污染则 RNA 的萃取就成功了一半。
因此在操作前的首要工作就是，将所有器械置于
180℃ 的高温下干烤 6 小时或更长时间；或者以 3% H2O2浸泡 30 分钟以上，再以灭过菌的 DEPC
水冲洗干净后，用铝箔包覆灭菌后使 用。在操做萃取时必须于清洁、无粉尘飞扬的环境，如果环境允许的话，最好在生物柜或化学柜中操作。
样品如何收集/保存？
先前我们提及细胞内存在有内源性 RNase，且其表现量在不同种类的组织中差异极大。
例如脑组织和心脏组织拥有相对低的内源性
RNase，但是胸腺组织和胰脏组织则保有约 100,000 倍于脑组织的内源
RNase。因此动物组织等最好都先用液氮冷冻起来，再进行后续的处理，不建议直接丢到-80℃ 冰箱。因为急速冻结可冻结 RNase
的活性，但-80℃ 冷冻算是缓慢降温，仍会造成部分 RNA 的降解; 如果无法快速冷冻检体，也可以采用市售的检体保存液，亦可达到不错的效果。
如何进行样品的破碎及均质化？
有关样品的破碎和均质化，这个步骤的重点应该摆在如何让有机裂解液快速浸润检体，
phenol-chloroform 可以溶解细胞，连带的会造成蛋白变性，因此内源性 RNase
的活性就会去活化；相反的如果无法让细胞快速裂解使蛋白裸露进而变性，则 RNase
就会降解RNA，因此如何使不同组织细胞快速裂解，就是一个值得思考调整的课题，也是左右成败的关键。
就检体类型来说， 一般培养细胞多为单层细胞不会遇到这样的问题，萃取较为容易，但是立体的组织进行萃取就会遇到均质化不均的问题进而造成 RNA 降解。因此低温的液氮碾磨就是破碎组织最有效的办法，但是液氮碾磨较为麻烦，如果遇到样品数比较多的 时候耗时费功效力不彰，但如果条件允许的话， 这仍然是一个好方法。
但考虑效率和速度，均质机就是一个更好的选择，但是使用均质机的过程有几个重点必须注意：
（1）速度要快，在 RNase 展现 活性前完成细胞均质化；
（2） 避免产热，以免降解 RNA；
（3）
不要过度研磨，过度研磨会打断 DNA， 造成小片段的 DNA
污染。此外，在均质裂解细胞的过程中有一个常被会忽略的重点，就是一般细胞和有机裂解液的比例常被忽略，有些操作者会认为多放一些组织就可以得到大量的
RNA，但是没意识到太多的组织和太少的裂解液，造成细胞 无法完全被裂解，RNase 无法完全被变性，效果反而适得其反，最后 RNA
严重降解。因此如果反应完后均质液太过粘稠无法分层，就必须再加入裂解液。
样品的离心分层
在
phenol-chloroform 的萃取方式中，混合液 的离心转数不可任意调整，应固定于 12000 g 的转
数，以免因沉降系数改变造成无法有效分层。当 离心完成后可以明显观察到检体分成上面水层及 下面有机层，而我们要的 RNA 就溶解在上面水层
中，体积约有 500~600μl 左右。
此时建议用小口 径的 100 或 200μl tip 将水溶液分段吸取到干净的1.5 ml 的离心管中，而在这个步骤常见的失误就是：操作的人急于将水层取出而搅动原先的分层; 或感 觉萃取不易想要多回收一些 RNA，于是将水层尽其可能的取出，因而造成吸取到有机溶液和大量的 DNA 污染（图三），造成后续实验处理上的困扰甚至实验失败，因此强烈建议只萃取7~8成的 RNA水溶液进行下一个步骤，
俗话说的好，所谓有失必有得，不必为了一颗树而放弃整片森林，适时的取舍可以确保后续实验顺利进行。此外一
般来说，phenol与水有一定比例的互溶，所以此时的RNA水溶液中仍有一定的phenol残留，建议一定要再使用chloroform进行一次离心分层去除残存phenol。
 | 图三、染色体DNA污染：安捷伦分析图谱(图右)和 电泳图 ( 图 左 ) 显示检体有大片段和大量小片段DNA污染。 |
RNA 样品的沉淀
一般我们会使用乙醇
（水溶液: 乙醇=1:2.5） 或异 丙醇 （水溶液: 异丙醇=1:1） 进行 RNA 沉淀，在效果上并无明显差异，但是如果已知 RNA
的含量是少 的，则可以使用乙醇沉淀法，并将检体置于-80℃ 冰箱间隔一个晚上再做离心的动作，并配合离心时间的增加，如此可增加 RNA
沉淀的回收率。
RNA 样品的清洗去除盐类
为了去除
RNA 沉淀物中的盐类，我们可以采用70~75% 乙醇进行洗涤，可能的话尽量让核酸沉淀
悬浮起来，最好的是使用两次洗涤，再将离心管放入离心机中离心，用移液器将残留的乙醇小心 吸掉，稍微抽干或吹干核酸沉淀物使残存的乙醇挥发后，再以
DEPC 水进行回溶。
