核提取物的制备实验
| 实验方法原理 |
通过向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化，可复原。对于特定的蛋白质，影响蛋白质盐析的主要因素：无机盐的种类、浓度、温度和PH值。 |
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| 实验材料 | 哺乳动物 |
| 试剂、试剂盒 | PBS 低渗缓冲液 低盐缓冲液 透析缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 转子 离心机 电导计 透析膜 匀浆机 离心管 |
| 实验步骤 |
1a. 收集转瓶培养的细胞：将浓度为5~10x108细胞/l 的培养液用1 L 的塑料瓶1 850 g 离心20 min，将细胞收入50 ml 锥形离心管中（每管收2~3 L 培养液中的细胞）。进行步骤2。
1b. 收集单层培养的细胞：单层细胞长满后去掉培养液。用PBS洗1次。将细胞刮入新鲜PBS液里，倒进锥形离心管中。进行步骤2。
3a. 转瓶培养细胞：测量压紧后细胞的体积。将细胞重悬于约5倍于其pcv的PBS液中，1 850 g 离心10 min。进行步骤4。
5. 在Dounce氏玻璃匀浆器中用B号研杵缓馒上下抽提10次以上。用台盼蓝染色排斥法在显微镜下检査细胞裂解滑况（应大于80%~90%）。
9. 25 000 g 离心30 min，测量核提取物的电导率（用上请，见步骤10）。
11. 将提取物从透析袋中移出45 000 g 离心20 min。
12. 用Bradford分析法测定上清中蛋白质的浓度。分装，浸入液氮中速冻，- 80℃保存。
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| 注意事项 |
所有步骤的操作均在0〜4℃进行，在冷室内操作更好。缓冲液和设备要预冷。所有离心均在4℃进行，转子要预冷。
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| 其他 |
细胞核提取方法的优化：
2. 将细胞核悬液分成5等份。在冷室内不断搅拌，按如下方法在每份悬液中加入1/3体积髙盐缓冲液，在第1份中加浓度最低（0.8 mol/l）的高盐缓冲液，其余各份中依次加入KCl浓度逐渐增髙（直到1.6 mol/l）的高盐缓冲液。轻轻混合30 min。
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