SFE-HPLC测定GBE中黄酮类化合物的含量
随着中药研究事业的不断发展，中药材在国内和国际的需求量越来越大，药物的重要有效成分的含量成为质量检查必不可少的参数，高效液相色谱的使用越来越广泛。针对高效液相色谱对药物尤其是中药材的检测，本文采用HPLC法测定了银杏叶中黄酮物质的含量。
2010年版《中国药典》共收载品种4600余种，新增1300余种。其中收载中药材、中药饮片、中成药和中药提取物标准增幅最大，新版药典共收载了2136个中药品种，比原来增加了900多种。同时新版药典强调用更先进的方式对中药进行含量测定、杂质鉴别、药物代谢动力学研究，实现与国际接轨。
高效液相色谱法以高速、高效、高灵敏度、高分离度的特点在药物的含量测定、组分分析、质量控制等各个方面广泛应用。在西药的分析中应用于质量控制，尤其表现在微量成分和痕量成分的分析。在中药材鉴定和质量分析上的应用也越来越重要，它的应用将促进我国中药质量的标准化和规范化。随着中药研究事业的不断发展，中药材在国内和国际的需求量越来越大，药物的重要有效成分的含量成为质量检查必不可少的参数，高效液相色谱的使用越来越广泛。
针对高效液相色谱对药物尤其是中药材的检测，本文采用HPLC法测定了银杏叶中的黄酮物质的含量。
图1. 槲皮素标准品色谱图。
银杏叶为银杏科植物银杏的（Ginkgo Biloba）叶子，经现代药理和临床研究表明银杏叶提取物可以软化血管，增加冠状动脉血流量，对心绞痛、脑血管疾病具有显著疗效，并且广泛应用于临床，我们采用超临界萃取技术萃取银杏叶中的黄酮类成分，通过水解后，用Labtech LC 600 高效液相色谱仪测定其黄酮苷之一槲皮素的含量，杂质干扰少，定量准确，回收率、重复性高。
实验部分
仪器与试剂
仪器：Labtech LC600 高效液相色谱仪；超临界流体萃取装置；Angel kromasil C18 （5um，250×4.6mm）；试剂：甲醇（AR. 北京化学试剂公司），磷酸（AR. 北京化学试剂公司），甲醇（色谱级J.T. Baker）；标准品：槲皮素对照品（Sigama），银杏叶提取物（GBE）（北京中硕医药开发有限公司）。
图2. 不同浓度槲皮素标准品标准曲线。
实验操作及条件
1.槲皮素标准曲线
1.1称取槲皮素标准品61.5mg，用甲醇溶解，在容量瓶中定容至100ml，作为槲皮素母液，备用。
1.2分别取母液0.2ml、0.5ml、1.0ml、3.0ml、6.0ml于50ml容量瓶中，用流动相定容，作为标准溶液，其浓度分别为：0.00246mg/ml、0.00615mg/ml、0.0123mg/ml、0.0369mg/ml、0.0738mg/ml。
1.3.HPLC法检测槲皮素标准溶液制备标准曲线。
实验条件：检测波长，360nm；流动相，甲醇:0.4%磷酸 = 50:50；流速，1ml/min；进样量，20μl；柱温，室温。
图3.银杏叶提取物中槲皮素含量色谱图。
2.银杏叶提取物的超临界流体萃取
2.1 装样：精确称取GBE 5.0mg，直接装入漏斗型聚四氟管内。
2.2 静态萃取：待萃取管温度和限流器温度稳定在60℃时，改性剂泵向系统中打入改性剂10ml，然后系统打压至5000psi，开始静态萃取，静态萃取时间40min。
2.3 动态萃取：静态萃取结束后，同时启动改性剂泵和二氧化碳泵，其流量分别为0.4ml/min和1.2ml/min；并调节限流器使得系统压力维持在5000psi+/-150psi，动态萃取40min。
2.4 收集：采用50ml收集管，加入20ml甲醇作为收集液进行收集。
2.5 水解：在接收液中按4:1的比例加入25%盐酸，在电热消解仪上85℃下，水解40min，迅速用冷水将样品冷却，用流动相定容到50ml作为带测试样品。
2.6 样品的HPLC测试：取上述水解定容后的样品按照1.3条件进行HPLC分析。
图4.银杏叶提取物中槲皮素（加标）色谱图。
实验结果
槲皮素标准曲线
分别取实验1.2配制的5个浓度水平的槲皮素标准溶液，用HPLC进行检测。槲皮素标准品色谱图如图1所示。
计算0.00246mg/ml、0.00615mg/ml、0.0123mg/ml、0.0369mg/ml、0.0738mg/ml 5个浓度标准品的峰面积，绘制标准曲线，其回归曲线及线性方程如图2所示。
银杏叶提取物中槲皮素的含量测定
对样品进行连续3次测定，其测定结果如表2所示。
经计算：GBE中槲皮素的平均含量为：0.01395mg/g，RSD为1.62%。
银杏叶提取物中槲皮素回收率实验
在漏斗型聚四氟萃取管中加入银杏叶提取物 5.0mg，槲皮素对照品约2.04.0mg，按实验前面所述样品萃取测试方法操作，计算加入槲皮素对照品的回收率。在相同条件下连续5次测定槲皮素加标回收率，计算其RSD。
经计算：五次萃取的槲皮素回收率均在85%以上，平均回收率为93.64%，RSD为5.37%。
结果与讨论
使用 LabTech LC 600 高效液相色谱仪可以快速简单地测定银杏叶提取物中的槲皮素，由谱图可知，银杏叶提取物中其他黄酮类物质对槲皮素的测定没有干扰，可以精确测定银杏叶提取物中槲皮素含量。通过加样回收实验，测定其回收率为85%以上，定量结果准确。此法为银杏叶提取物中黄酮类物质的测定提供了一个快速简单的方法，为广大药厂、医院、科研单位提供了优良的解决方案。
