植物组织培养中常用灭菌方法（二）
4、不耐热的物质采用过滤灭菌
一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。
一些化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能。经高温灭菌后赤霉素GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。蔗糖经高温后部分被降解成d-葡萄糖和d-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质。高温还可使碳水化合物和氨基酸发生反应。维生素具有不同程度的热稳定性，但如果培养基的ph值高于5.5，则维生素b1会被迅速降解。泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌，不能高温灭菌，否则会失去作用。
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45微米以下，当溶液通过滤液后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。
过滤除菌操作步骤：首先将过滤器、接液瓶用纸包好，滤膜可放在培养皿内用纸包好。使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30分钟；在超净工作台上，将滤器装置装好，用灭菌无齿镊子将滤膜安放在隔板上，滤膜粗糙面向上；然后将待除菌的液体注入滤器内，开动真空泵即可过滤除菌。滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。
5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌
（1）紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200-300nm，其中260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2米为宜。
（2）熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。
常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
6、一些物体表面用药剂喷雾灭菌
物体表面可用一些药剂涂搽，喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用75%的酒精反复涂搽灭菌，1%-2%的来苏儿溶液以及0.25%-1%的新洁尔灭也可以。
7、植物材料表面用消毒剂灭菌
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接种到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体（explant)。
启维益成代理的植物组培抗菌剂（PPM）它是一种广谱抗微生物剂，可以杀死细菌和真菌细胞，防止真菌孢子的萌发，并在较高浓度下能消除内源性污染的外植体。
首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸泡10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1-2种使用（表2）。
表2. 常用灭菌剂使用浓度及效果比较
灭菌剂名称 | 使用浓度 | 灭菌时间/min | 灭菌效果 |
酒精 | 70-75% | 0.1-3 | 好 |
氯化汞 | 0.1-0.2% | 2-10 | 很好 |
漂白粉 | 饱和溶液% | 5-30 | 很好 |
次氯酸钙 | 9-10% | 5-30 | 很好 |
次氯酸钠 | 2% | 5-30 | 很好 |
过氧化氢 | 10-12% | 5-15 | 好 |
抗菌素 | 4-50mg/L | 30-60 | 较好 |
上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒去除，所以应当用无菌水漂洗8-10次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒。
灭菌时，不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾倒干净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
在灭菌溶液中加吐温-80或triton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。
最后一步是用无菌水漂洗，漂洗要求3分钟左右，视采用的消毒液种类，漂洗3-10次左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
