实验方法原理 磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸降解后释放出丝氨酸或苏氨酸和自由磷酸盐，而磷酸酪氨酸降解后释放出磷酸酪氨酸的衍生物——苯胺基噻唑啉酮。

实验材料 洗脱的磷酸肽（见辅助方案 1）

试剂、试剂盒 5%(V／V)异硫氰酸苯酯(PLTC)溶于吡啶中10:1(V／V)庚烷／乙酸乙酯-10 份庚烷与 1 份乙酸乙酯混合2:1(V／V)庚烷／乙酸乙酯-2 份庚烷与 1 份乙酸乙酯混合 100%(m V)三氟乙酸(TFA) 电泳缓冲液(pH 1.9 200~500 cpm 32P（用去离子水稀释 32P 正磷酸盐配制)或 2 mg／ml PTH-磷酸酪氨酸

仪器、耗材 微量离心管45℃ 水浴适用于契仑科夫计数法的闪烁计数器TLC 平板(20 cm × 20 cm 100 μm 纤维素)65℃ 烘箱或风扇

实验步骤

1. 根据候选肽段的列表确定循环数。

将循环数指定为^每一循环的起始体积为 20 μl。

2. 在称为反应管（微量离心管）的管子中将洗脱的肽溶解于 20 μl 去离子水中。

3. 取 20/（x+1）μl 的一份样品到一新的管子中；此为起始样品材料，储存于 4℃。

4. 补加去离子水到反应管中，使总体积恢复到 20 μl。此时开始对样品进行计数：

4.1 确保从起始样品中实际取出所需的 cpm 量（作为起始样品材料）；

4.2 在每一循环开始时检测 cpm。

5. 每个反应管中加入 20 μl 5%（V/V）异硫氰酸苯酯（溶于吡啶中），充分涡旋振荡混匀，短暂离心收集液体至管底，45℃ 孵育 30 min。

6. 每个反应管中加入 200 μl 10:1 庚烷/乙酸乙酯，涡旋振荡 15 s。全速离心 1 min 分离两相。

吡啶会进入有机相（上层）。

7. 用带塑料吸头的移液器，小心吸去上层有机相。按步骤 6 的方法用 10:1 庚院/乙酸 乙酯再次抽提水相（下层）。

8. 按步骤 6 的方法用 2:1 庚烷/乙酸乙酯抽提水相 2 次。

9. 在干冰上冷冻水相，然后在 SpeedVac 蒸发器中冻干。

10. 将干的样品重新溶解于 50 μl 100% 三氟乙酸（TFA），45℃ 孵育 10 min。

11. 在 SpeedVac 蒸发器中冻干样品。

12. 用契仑科夫计数法对样品计数。

测得的 cpm 应当与循环开始时的值（即步骤 4）相同。

13. 往反应管中加入 20μl 去离子水，涡旋振荡，短暂离心。取出 20/x μl 第一个循环的产物用于分析。取出的样品与起始样品一起储存于 4℃。

14. 补加去离子水到反应管中，使总体积恢复到 20μl，开始第二轮反应。重复步骤 5~12。

15. 第二轮反应后，加 20μl 去离子水重悬剩余的样品，取出 20/（x -1）μl 转移到新的管中作为第二轮产物以待分析。重复步骤 4~12。

16. 继续重复步骤 4~12 的操作，直至进行到所需的反应轮数。

对于每一新的循环，所取的样品量为 2（x-y）μl，此处 y 等于循环轮数减去 1。

17. 将所有样品在 SpeedVac 蒸发器中冻干。用契仑科夫计数法对所有的最终样品进行计数。

18. 如果进行了冻干，用 5μl pH 1.9 的电泳缓冲液或去离子水溶解样品。以最大速度离心 2 min 以沉淀不溶的物质。

如果每轮反应后所取样品的体积很少，可以跳过步骤 17 和 18，将样品直接上样到 TLC 平板上。

19. 将分析一个既定的磷酸肽的所有样品以至少 1 cm 的间距点样于 TLC 平板中心的一条垂直线上的起始点（见图 17.9.5）。将 50~200 cpm [32P] 磷酸盐或 1~2 μg PTH-磷酸酪氨酸（0.5~1.0 μl 2 mg/ml PTH-憐酸酪氨酸储液）（取决于所研究的 肽的磷酸氨基酸的组成）作为标记点样于位于同一垂直线上的起始点。点样时每次滴加 1/3~1/2 μl 样品，干燥后再滴加下一滴（见基本方案 1 步骤 25）。

20. 如图 17.9.5，浸湿平板。

21. 准备 HTLE7000 装置，以 1.0 kV 电压在 pH 1.9 的电泳缓冲液中电泳 25 min（见基本方案 1 和图 17.9.3）。

22. 待平板干燥后（用 65℃ 烘箱或风扇），用放射性或荧光标记物进行标记，在增感屏 的辅助下于 -70℃ 对预敏化的胶片曝光（放射自显影）。