实验材料 新生儿脐带

试剂、试剂盒 PBS胶原酶M199培养基胰酶EDTADMEM培养基

仪器、耗材 针头手术钳离心管低温离心机弯管明胶恒温培养箱显微镜

实验步骤

1. 将15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的PBS 溶液中储存。（注：4℃下最多贮存24 小时，室温下不超过6 小时，否则废弃）

2. 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS 溶液冲洗3-5 次，将污血冲洗干净为止。

3. 用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带

4. 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml 无菌离心管中，用无菌的PBS 溶液冲洗脐带2-3 次。

5. 将收集液离心（2000 转/分）3 分钟。

6. 倒去上清，加入10ml M199 培养基（加入10U/ml 的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。（注：每个培养瓶中加入3-4ml 无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2 小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。）

7. 培养24 小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS 溶液清洗2-3 次，洗掉红细胞和死细胞，加入10 ml 新鲜的M199 培养基。

8. 以后每2 天换一次培养基（每次换掉2/3 的培养基）。

9. 一般培养5-7 天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10. 倒掉培养基，用无菌的PBS 溶液清洗2-3 次，加入2-3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3 倍的有血清的DMEM 培养基终止反应。

11. 用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50 ml 无菌离心管中，2000 转/分，离心3 分钟。

12. 倒掉上清,加入10ml 新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4 瓶.以后照此传代培养.

13. 一般传代2-3 代（培养了20 天左右）用于做各种实验效果最好。