亲和层析

    （一）原理

    亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

    此法具有高效、快速、简便等优点。

   （二）载体的基本要求和选择

理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

    可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

    琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。

    琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。

    （三）试剂与配制

    1．Sepharose 4B

    2．CNBr（剧毒）

    3．抗原或抗体

    4．1Mol/L NaHCO₃  取NaHCO₃ 84.01g加水至1 000ml。

    5．0.1Mol/L NaHCO₃

    6．2Mol/L NaOH

    7．0.01Mol/L pH7.4 PBS

       0.2Mol/L Na₂HPO₄   38.0ml

       0.2Mol/L Na₂HPO₄  162.0ml

                NaCl      32.76g

    加水至4 000ml。

    8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液  甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

    9．7Mol/L尿素

    10．0.2Mol/L NaHCO₃,（含0.1Mol/L NaCI）

       1Mol/L NaHCO₃  100.00ml

              NaCl     2.93g

       加水至500.00ml。

    （四）实验方法

    1．琼脂糖活化

    ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO₃液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。

    ⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0～11.0维持10min。

    ⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO₃抽洗。

2．偶联蛋白  20ml 4B液体相当于一半的固相载体。

⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO₃液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。

⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。

3．装柱

    ⑴ 选柱：不宜过大，一般以1.5×375px的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。

    ⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。

    ⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO₃（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD₂₈₀＜0.02为止。

收集全部的洗脱液，测得的OD₂₈₀值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。

4．吸附与解吸附

    ⑴按床体积1/10加样，浓度为1％～2%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD₂₈₀＜0.02为止。

    ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO₃中和，以免蛋白变性。

5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N₃于4℃保存。防止冷冻和干裂。

6．结果判定

    ⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。

⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。