RNA的琼脂糖凝胶电泳实验
| 实验方法原理 |
RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%~1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 |
|---|---|
| 实验材料 | RNA样品溶液 |
| 试剂、试剂盒 | 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 溴化乙锭 载样缓冲液 MOPS缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 电泳仪 电泳槽 电子天平 移液器 枪头 微波炉 紫外透射检测仪 封口膜 |
| 实验步骤 |
一、实验材料、器具及药品
蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5 ug/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。
二、实验步骤
1. 用1xTAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1xTAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
2. 在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4 ul于封口膜上。在实验台上再加入5 ul 1xTAE电泳缓冲液及1 ul 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
3. 打开电源开关，调节电压至100 V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5 min，用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
三、 RNA的变性琼脂糖凝胶检测
1. 试剂
（1）MOPS缓冲液（10*）:0.4 mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） (pH7.0)，0.1 mol/L NaAc，10 mol/L EDTA。
（2）上样染料：50%甘油，1 mmol/L EDTA ，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。
（3）甲醛。
（4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲洗-乙醇干燥-3%H2O2灌满-室温放置10分钟-0.1%DEPC水冲洗。
2. 操作
（1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。
（2） 配制琼脂糖凝胶。
①称取0.5 g琼脂糖，置干净的100 ml 锥形瓶中，加入40 ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。
②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9 ml 甲醛、5 ml 10X MOPS缓冲液和0.5 ul 溴化乙锭，混合均匀。
③灌制琼脂糖凝胶。
（3） 样品准备：
① 取 DEPC处理过的500 ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2 ul，甲醛3.5 ul，甲酰胺（去离子）10 ul，RNA 样品 4.5 ul，混匀。
② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。
③ 向管中加入3 ul 上样染料，混匀。
（4）上样。
（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5 V/ml 的电压下电泳。
（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
展开 |
| 注意事项 |
RNA琼脂糖凝胶电泳中务必去除RNASE酶的污染，所有的试剂需用DEPC水配制，所用的器材也要的DEPC处理并灭菌，防止RNA被降解。
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