大鼠大脑皮层神经元细胞培养实验
机械性划割培养
酶消化法
| 实验方法原理 | SD胎鼠脑皮层神经元体外培养7 d ，微量移液器塑料滴头于培养孔内机械性划割培养之神经元，依划割程度不同分为轻、中、重3组，对照组除不进行机械性划割，其余处理同损伤组，伤后不同时间点（10，30 min ， 1，3，6，12，24 h）检测细胞存活率及培养液上清乳酸脱氢酶(LDH)含量。 |
|---|---|
| 实验材料 | SD大鼠 |
| 试剂、试剂盒 | 硼酸硼砂缓冲液 胰酶-EDTA 消化液 D-Hanks’ |
| 仪器、耗材 | 眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱 |
| 实验步骤 |
一、实验步骤
1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。
2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的 DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤 2～3 次。
5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。
6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成单细胞悬液。
7. 细胞计数，调整细胞密度按1.5x105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。培养48 h 后换液并 加入Ara-C使其终浓度为 1x10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量换液。以后每隔 3 天半量换液一次。
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| 注意事项 |
1. 上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动：如消化时可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶进行消化，有人还直接进行吹打，都可行。
2. 上面虽然时大鼠皮层神经元，但是同样适用于小鼠，但是应该选择孕13 d 左右的小鼠。
3. 神经元是一种比较难培养的细胞，因此在接种时细胞的密度一定要够。
4. 在玻片上培养神经元时，一定要注意玻片的来源和处理方法，这个非常重要，对神经细胞的影响 是很大的。如果您现在在玻片上培养的神经元生长情况还不错的话，那么您在以后的培养中最好还是用同 一来源(厂家)的玻片。
5. 如果有B27 和neurobasal 培养基，那么就方便了(不用加 AraC):
(1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成 2% B27 的 neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。
(2)把细胞悬液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培养基悬浮接种。
(3)可以用新生1 d 内的胎鼠皮层直接培养。
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