从培养细胞或组织中制备细胞核基质/中间纤维骨架结构
从培养细胞中制备细胞核基质/中间纤维骨架结构
从组织中分离制备细胞核基质/中间纤维支架结构
细胞核的预先分离
| 实验材料 | 细胞 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | Tritron X-100 抽提缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 电子显微镜 |
| 实验步骤 | 1. 在 4℃ 用 PBS 洗细胞一次。 2. 在 4℃ 用含 0.5% Tritron X-100 的细胞骨架缓冲液抽提细胞 3 到 5 分钟。直到消化步骤，每 107 个细胞最少要用 1 ml 缓冲液，以后减半。 3. 在 4℃ 用抽提缓冲液抽提细胞 3~5 分钟。这一步去除组蛋白 H1 和除中间纤维蛋白之外的细胞骨架蛋白。另外，这一步也可在 DNA 酶消化步骤（第 4 步）之后作，这样也不会引起超微结构的变化。 抽提缓冲液： 10 mmol/L PIPES，pH 6.8 250 mmol/L 硫酸铵 300 mmol/L 蔗糖 3 mmol/L MgCl2 1 mmol/L EDTA 4. 在含 0.5% Triton X-100 的消化缓冲液中用无 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色质 DNA 酶浓度为 200~400 单位/ml，32℃ 反应 30~50 分钟。 含 0.5% Triton X-100 的消化缓冲液： 10 mmol/L PIPES，pH 6.8 300 mmol/L 蔗糖 50 mmol/L NaCl 3 mmol/L MgCl2 1 mmol/L EGTA 5. 用抽提缓冲液清洗样品两次，每次 5 分钟。 6. （可选）样品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分钟。这一步能使可能形成核基质核心的 10 nm 纤丝分支显形（Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ（每种酶 400 单位/ml）代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纤丝保存的更好。 2 mol/L NaCl 缓冲液： 10 mmol/L PIPES，pH 6.8 300 mmol/L 蔗糖 2 mol/L NaCl 3 mmol/L MgCl2 1 mmol/L EGTA 7. 固定核基质以进行免疫荧光检测或电子显微镜检测。 |
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