在MD两款酶标仪上应用Promega CellTiter-Glo化学发光法检测...
在MD两款酶标仪上应用Promega CellTiter-Glo化学发光法检测细胞活性
介绍
Molecular Devices公司的SpectraMax®
L及SpectraMax®M5型号酶标仪结合Promega公司的CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒能进行快速灵敏的活细胞数量测定。CellTiter-Glo检测法使用了萤光素酶，需要ATP使其反应发光。发光信号强度由ATP量决定，而ATP的多少取决于活细胞数目。SpectraMax®
L及M5酶标仪均能提供96孔和384孔化学发光检测功能。
材料
CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒(Promega公司，货号G7570)，包括CellTiter-Glo缓冲液和CellTiter-Glo底物(冻干粉)
CHO-K1细胞(ATCC，货号CCL-61)
白色96和384孔板(Greiner Lumitrac 200，货号655075和781075)
SpectraMax® L化学发光微孔板检测仪或SpectraMax® M5多功能微孔板读板机
方法
准备CellTiter-Glo试剂使用前将CellTiter-Glo缓冲液和底物在室温中平置解冻。然后将缓冲液倒入装有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手册中指示，温和颠倒瓶子以混匀。
细胞计数及产生发光信号
用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham’sF12培养基培养CHO-K1细胞。胰酶消化后使细胞悬浮在培养基中，并进行细胞计数。用96孔板检测时，每孔中加入100ul细胞悬液，细胞浓度从50000个/孔稀释到24个/孔。384孔进行检测时，每孔中加入25ul悬液，细胞浓度从12500个/孔稀释到25个/孔。空白孔中加入不含细胞的培养基，用于检测背景光值。
为了确保CellTiter-Glo检测中细胞数量的准确性，细胞不能贴壁和生长，但能及时被检测到。每孔中加入100ul(96孔板)或25ul(384孔板)CellTiter-Glo试剂。然后将微孔板放在振荡器上温和振荡混匀2分钟，室温孵育10分钟，使其产生稳定的发光信号。
制作ATP标准曲线
ATP标准样品用培养基制备，浓度范围从100 fmol/孔到1nmol/孔(96孔板)，或25 fmol/孔到250
pmol/孔(384孔板)，按上述同样体积加入微孔板中。空白对照孔加入不含ATP的培养基。适量CellTiter-Glo试剂加入每孔，并按上述步骤孵育。
仪器设置和样品分析
检测板用SpectraMax® L和SpectraMax®M5酶标仪进行读数，并使用SoftMax®
Pro软件中预设参数的CellTiter-Glo模板。根据Promega推荐，检测时间设置为1秒。然后在SoftMax®
Pro软件上进行平均发光强度和标准偏差计算，细胞浓度稀释曲线和ATP标准曲线作图。
结果
SpectraMax® L和SpectraMax®
M5酶标仪均最低能检测24个细胞/孔(96孔板)和6个细胞/孔(384孔板)。因此其灵敏度高于比色法和荧光检测法。CellTiter-Glo化学发光检测值在所用的细胞浓度范围内呈线性分布，并达到大于3个数量级的动态范围(r2=
0.99)。(见图1)
ATP标准曲线能用于验证试剂盒以及计算细胞ATP含量。ATP标准曲线中ATP浓度范围对应检测值覆盖了细胞数量检测中的发光值全部范围(见图2)。检测值至少在4个数量级范围内呈线性。
结论
SpectraMax® L和SpectraMax®
M5酶标仪均为CellTiter-Glo检测提供了优异的检测灵敏度。SpectraMax®
L化学发光读板机带有自动增益功能，能同时进行模拟信号和光子计数，提供大于9个数量级的动态范围，对于高信号值样品无需稀释，同时对于低信号样品具有优越的灵敏度。
SpectraMax® M5多功能读板机为使用者提供了除化学发光以外的其他检测方法，例如：光吸收，荧光强度，荧光偏振和时间分辨荧光。
SpectraMax® L和SpectraMax® M5酶标仪均用SoftMax® Pro软件进行操控和设置，该软件含有CellTiter-Glo检测模板和其他120多个分析模板，这些模板已预设参数，方便数据整理和分析。两种酶标仪均能整合MD公司的StakMax®微孔板移动机械臂，以实现微孔板的自动装卸。
