前言

　　传统的 ELISA ( 酶联免疫吸附实验 ) 方法使用辣根过氧化物酶 (HRP) 底物3, 3’ , 5, 5’ -四甲基联苯胺 (TMB) 通常无法检测低丰度分析物，例如炎性细胞因子。SwordDiagnostics公司开发出新一代ELISA检测技术-Sword ELISA Booster，可直接替代作为金标准的传统 ELISA 检测试剂，将灵敏度提升 30 倍。

　　Sword ELISA Booster 通过加入专有的检测试剂来进行免疫化学测定。Sword 分子在辣根过氧化物酶 (HRP) 存在下转化为共振拉曼活性底物，共振拉曼信号则在微孔读板机上检测。由于在低浓度下有着极高水平的酶/底物相互作用，产生出更多的共振拉曼活性分子，从而增强了实验的性能表现。与传统 ELISA 检测试剂相比，这一实验具有更高灵敏度、更低 CV 值和更少噪音。

　　这里，我们使用 Sword ELISA Boosters 实验在 Molecular Devices 公司 SpectraMax®iD3、i3x 和 M5 多功能微孔读板机的荧光模式下检测炎性细胞因子 TNF-α 和 IL-1β。在上述三台读板机上分别检测浓度低至pg/mL 的这两种待测物。

　　优点

　　 -低丰度分析物的高灵敏度检测

　　 -专有的 Sword 分子对传统 ELISA试剂的增强

　　 -低背景噪音和 CV 值

　　材料

　　 -用于人 IL-1β 检测的 Sword ELISA Booster (Sword Diagnostics cat.#SB-HIL1B02-05)

　　 -人 IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA (R&DSystems cat. #DY201)

　　 -用于人 TNF-α 检测的 Sword ELISA Booster (Sword Diagnostics cat.#SB-HTNFA02-05)

　　 -人TNF-α DuoSet ELISA (R&D Systemscat. #DY210)

　　 -包被有 Nunc MaxiSorp 的免疫清洁标准模块 ( 条形孔板 ) (Thermo Scientific cat.#445101)

　　 -SpectraMax iD3 多功能微孔读板机

　　 -SpectraMax i3x 多功能微孔读板机

　　 -SpectraMax M5 多功能微孔读板机

　　 -MultiWash+ 洗板机

　　方法

　　准备工作液和孔板，两款试剂盒实验过程参照以下描述。更多关于试剂操作和方法的细节请参考产品手册。

　　Sword ELISA Booster底物溶液

　　为准备 16 mL 足够用于 96 孔板的Sword ELISA Booster 底物溶液，以下试剂需再加入 11.2 mL 去离子水：

　　 -1.6 mL Sword Booster Component A (10x)

　　 -1.6 mL Sword Booster Component B (10x)

　　 -1.6 mL Sword Booster Component C (10x)

　　1x Sword Development 溶液

　　为准备 16 mL 足够用于 96 孔板的Sword Development 溶液，3.2 mL 5x Sword Development 溶液 (Component D) 加入 12.8 mL 去离子水。

　　准备孔板

　　IL-1β 和 TNF-α 捕获抗体分别重溶于0.5 mL PBS 中制成抗体浓缩液。浓缩的人 TNF-α 捕获抗体在 PBS 中稀释至12 μg/mL，人 IL-1β 捕获抗体稀释至 4μg/mL，制成工作浓度。每块实验孔板分别包被 100 μL/孔的稀释后抗体。然后将孔板密封并在 4°C 下孵育过夜。

　　使用 MultiWash+ 微孔洗板机，以 400μL/孔清洗缓冲液 (PBS + 0.5% Tween20) 清洗孔板 3 次，每次吸液前先让清洗缓冲液在孔中停留 15-30 秒。然后每块孔板以 200 μL/孔用于 IL-1β 或TNF-α 的 Sword ELISA Blocker 进行封闭，密封并在室温下至少孵育 1 小时。再次如上所述清洗孔板。