乌司他丁溶液的检查及鉴别方法

鉴别

(1)取本品,用水稀释制成每1ml中含1000单位的溶液,取0.5ml,加5%苯酚溶液0.5ml,摇匀,加硫酸2.5ml,摇匀,溶液显橙黄色(2)取本品,用效价测定项下的0.2mol/L三乙醇胺缓冲液(pH7.8)稀释制成每1m中含200单位的溶液,作为供试品溶液。取试管1支,加上述缓冲液1.6ml、供试品溶液0.2m与效价测定项下的胰蛋白酶溶液0.2ml,摇匀,置25℃水浴保温5分钟,加效价测定项下的底物溶液1.0ml,摇匀,置25℃水浴继续保温5分钟,溶液应无色。另取试管1支,以上述缓冲液0.2ml代替供试品溶液,同法操作,溶液应显黄色(3)取本品,用水稀释制成每1ml中含2000单位的溶液,照紫外可见分光光度法(通则0401)测定,在277nm的波长处有最大吸收。(4)取本品,用0.9%氯化钠溶液稀释制成每1ml中含00单位的溶液。用硼酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.4)(取硼酸4.736g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释至1000m)制备1.2%琼脂糖凝胶板,照免疫双扩散法(通则3403)检查,应与兔抗乌司他丁血清形成明显的沉淀线

检查

酸碱度取本品,用水稀释制成每1ml中含10000单位的溶液,依法测定(通则0631),pH值应为6.0~7.5。溶液的澄清度与颜色取本品,用0.9%氯化钠溶液稀释制成每1ml中含20000单位的溶液,依法检查(通则0901第一法和通则0902第一法),溶液应澄清无色;如显色,与黄色1号标准比色液比较,不得更深。激肽原酶物质照紫外可见分光光度法(通则0401)测定底物溶液取S2266(相当于 H-D-Val- Leu-Arg-PNA2HCl)25mg,加水溶解并稀释制成0.0015mol/L的溶液,置18℃保存。供试品溶液取本品,用水稀释制成每1n中约含000单位的溶液。测定法取试管2支,各精密加入供试品溶液0.4ml,再分别加入0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(取三羟甲基氨基甲烷24.228g,加水800ml溶解,用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0,加水至1000m)0.5ml,混匀,置37℃士0.5℃水浴中保温5分钟,再于第1管中加冰醋酸溶液(1→2)lml,第2管中加底物溶液0.1ml,立即摇匀,并计时,置37℃士0.5℃水浴中准确反应30分钟,第1管加底物溶液0.lml,第2管加冰醋酸溶液(1→-2)0.1ml,以第1管为空白,在405nm的波长处测定第2管的吸光度。限度吸光度不得过0.03分子量取本品适量,用水稀释制成每1ml中含2mg蛋白的溶液,加入等体积的供试品缓冲液,混匀,置水浴中5分钟,放冷,作为供试品溶液;另取分子量标准品(分子量为0000~100000标准蛋白质)适量,加供试品缓冲液制成每l中含1gg的溶液,置水浴中5分钟,放冷,作为分子量标准品溶液。照电泳法(通则0541第五法还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法),考马斯亮蓝染色测定,分离胶浓度为12.5%。加样量不低于10g。分子量应为37000~430有关物质照分子排阻色谱法(通则0514)测定。供试品溶液取本品,用流动相稀释制成每1m中约含10000单位的溶液。对照溶液精密量取供试品溶液1m,置200ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀系统适用性溶液取供试品溶液适量,于105℃加热3小时,放冷,加入等体积的供试品溶液,混匀灵敏度溶液取对照溶液10ml,置25ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀。色谱条件以亲水改性硅胶为填充剂( TSKgel G3000sWXL,7.8mm×300mm,5m或其他适宜色谱柱);以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠6.90g磷酸氢二钠17.91g及氯化钠8.7g,加水800ml溶解,调节pH值至6.8,加水至1000m)为流动相流速为每分钟0.7ml;检测波长为280nm;进样体积50pl系统适用性要求系统适用性溶液色谱图中,乌司他丁峰与相邻杂质峰间的分离度应符合要求,理论板数按乌司他丁峰计算不低于800。灵敏度溶液色谱图中,乌司他丁峰高的信噪比应大于10测定法精密量取供试品溶液与对照溶液,分别注入相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍限度供试品溶液色谱图中如有杂质峰,各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的4倍(2.0%)。重金属取本品适量(约相当于乌司他丁50万单位),用水稀释制成每1ml中约含乌司他丁5万单位的溶液,取10ml依法检查(通则0821第二法),每1ml中含重金属不得过10μg。乙肝表面抗原取本品,用0.9%氯化钠溶液定量稀释制成每1ml中约含10万单位的溶液,按试剂盒说明书测定,应为阴性。异常毒性取本品,用氯化钠注射液定量稀释制成每ml中约含鸟司他丁45000单位的溶液,依法检查(通则141),应符合规定。细菌内毒素取本品,依法检查(通则1143),每10000单位乌司他丁中含内毒素的量应小于0.625EU凝血质样活性物质血浆的制备取新鲜兔血,置预先放有3.8%枸橼酸钠溶液的容器(枸橼酸钠溶液与血液容积之比为1:9)中,混匀,在2~8℃条件下,以每分钟3500转离心0分钟。取上清液在-20℃保存备用,用前在25℃水浴融化。测定法取本品,用巴比妥缓冲液(pH7.4)稀释制成每ml中含5000单位的供试品溶液。取试管[(10~12)mm5mm]2支,第1管加巴比妥缓冲液(pH7.4)0.1ml作空白对照,第2管加供试品溶液0.1ml,分别加兔血浆0.1ml,置25℃士0.5℃水浴中保温5分钟,迅速加入0.37%氯化钙溶液lml,混匀,计时。观察并记录试管出现混浊(初凝)的时间供试品管的初凝时间应不小于空白对照管的初凝时间。