基 本 方案 1 蛋白质或多糖抗原体内法诱导抗体的产生

材 料

人外周血
类毒素混合物： 25Lf U/ml 白 喉 类 毒 素（Connaught Laboratories 或 State Laboratoriy Institute of Massachusetts) 与 IOLf U/ml 破 伤 风 类 毒 素（State Laboratoriy Institute of Massachusetts) 的混合物

多 价肺炎球菌疫苗（如 Pneumovax 23、 Merck 或 Pnu-Immune 23、 Lederle)

皮下注射器和酒精棉球

1 . 采集 正 常 人 外 周 血（附 录 3 G ) ，血凝后，离心分离血清，一 20〜一 70°C 保存

2 . 用皮下注射器肌注（三头肌或大腿肌肉）〇 .5m l 类毒素混合物，注意避开血管。注射 后 24 h 内应密切观察，防止过敏反应的发生（尽管少见），出现情况及时处理。

3 . 或者皮下注射〇 .5m l 多价肺炎球菌疫苗。注 射 后 应密切观察，出现情况及时处理(曾经接受疫苗注射的人发生过敏反应的概率增加）。

4.免疫后第 1、 2 和 3 周采血。若只采血一次，可在免疫后第 2 周采血。检 测 IgM 时，应在免疫后第 3〜7 天采血。分离血清后，血清置一 20〜一 70°C 保存。

5.E L I S A 法检测样品中抗体的含量（见基本方案 2)。

基 本 方 案 2 ELISA 法检测体内抗体的产生

材 料

碳酸盐缓冲液， P H 9. 6 或 PBS (见相关手册）

抗原：白喉类毒素、破伤风类毒素、 I 或 II 型肺炎球菌多糖或蛋白质偶联的 III 型

肺 炎 球 菌 多 糖（见辅助方案）

NaN3，推荐使用

Tween/P B S : 含 0 •0 5 % (VTV) Tween 20 的 PBS (4 〇 C 可储存 1 月）

含 1 % ( V A O 胎 牛 血 清（fetalcalfserum， F C S , 56°C ， Ih 灭 活 ）或含 0.1%(m /V ) B S A 的 P B S ，推荐使用

血清标准品和待测血清，避免反复冻融

F C S /Tween/P B S : 含 0.1% F C S (56°C ， Ih 灭活）的 Tween/PBS

碱 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase， A P ) 标记的二抗：特异性针对人抗体的 K 和入轻链，以及抗人 IgG、 I g A 和 IgE 抗 体（Tago)

底物，新 鲜 配 制（每 板 需 6m l 左右）

3mol/L N a O H

破伤风类毒素和白喉类毒素标准品

9 6 孔平底培养板及盖子（Costar)

半自动或全自动洗板仪（Dynatech)

酶联仪

1 . 取 9 6 孔板，预留第一列作为空白对照，在余下的每列中间隔（如 第 2、 4、 6、 8、 10列）加 入 150M1 碳 酸 盐 缓 冲 液（检测类毒素抗原）或 PBS (检测多糖抗原）。

2 . 用碳酸盐缓冲液将白喉类毒素和破伤风类毒素分别稀释至 0. 22Lf U /m l 和 0. 56LfU /m l ; 用 P B S 将 I /I I 型肺炎球菌多糖和蛋白质偶联的 III 型肺炎球菌多糖分别稀释至 0 •025m g /m l 和 1〜3/^g/m l 。将稀释的抗原各取 150^1 加入上述剩余的各纵列孔中(如第 3、 5、 7、 9、 1 1 列），置 4°C 孵育过夜。若 加 入 0 . 0 2 % N a N 3 后 ，培养板可保存 4 周 。

3 . 用 半 自 动 或 全 自 动 洗 板 仪 洗 板 3 次 ，每 次 加 入 200 Ml T w e en/P B S ，洗 板 间 隔 1〜2 min。最后拍干残余的洗液。

4 . 备选操作：为降低非特异性结合，可 加 入 100〜 150/xl 含 1 % F C S 或 0. 1 % B S A 的P B S 。室温孵育 Ih (或 4°C 过夜），然 后 洗 板（检测白喉类毒素和破伤风类毒素抗原时不需此步骤）。

5 . 将标准血清 3 倍系列稀释，制作标准曲线。方法如下：在 第 2〜3 列的第一排孔中加入 150ul 最高浓度的标准品（包括抗原包被孔和抗原未包被孔）。第 2〜3 列余下的孔中加入 100ulFC S /Tween/P B S 。用多道移液器从第一排的两孔中各吸取 50M1 血清分别加入第二排的对应两孔中，将 血 清 进 行 3 倍稀释。轻轻吹打混勻后，同上依次在 第 2〜3 列余下的各孔中进行血清 3 倍系列稀释。最后，从最末一排的两孔中各吸
弃 50M1 稀 释 的 血 清（此时所有孔的终体积为 lOOul)。

6 . 将成对的待测血清（免疫前和免疫后）稀释后加到上述 9 6 孔板中。方法如下：在相应 的 2 纵 列（包括抗原包被列和抗原未包被列） 最上面的两孔中，各 加 入 150ul 稀释后的 待 测 血 清（通 常 1 : 4 0 , 免疫后血清稀释度可更高些）。 2 纵列余下的各孔中加 入 IOOul F C S /Tween/P B S 。参照步骤 5 将待测血清进行 3 倍系列稀释。

7 . 室温孵育 2 h 或 4°C 过夜。用 Tween/P B S 洗 板 3 次 ，拍干残余的洗液。

8 . 用 F C S /Tween/P B S 将 A P 标记的二抗稀释至合适浓度。用多道移液器在每孔中加入 IOOul 抗 体 。第 一 列 为 空 白 对 照 ，只 加 F C S /Tween/P B S 。室 温 孵 育 2 h 或 4°C过夜。

9 . 加 入 Tween/PBS 洗 板 3 次 ，拍干残余的洗液。每孔中加入 IOOmI 新鲜配制的底物溶液 ，室温显色。酶联仪检测吸光值，待标准品最高浓度孔中的 A 4q5 吸 光 值 达 1.0 时 ，在每孔中加入 lOOjul 3mol/L N aO H 终止显色。

10 . 将数据输入计算机，进行处理和分析。分析结果时，应将样品孔的吸光值减去空白对照孔的吸光值。

11 . 将待测样品的吸光值与标准品的吸光值进行比较。指定未稀释标准品的抗体效价为1000 抗体单位，计算出样品的抗体单位。最好能将标准品对照国际白喉类毒素和破伤风类毒素标准品换算出国际标准值，然后计算样品值。

辅 助 方 案 肺 炎 球 菌 多 糖 与 蛋 白 质 的 偶 联

III 型 肺 炎 球 菌 多 糖（和其他型肺炎球菌多糖，如 6A 、 9、 1 4 和 1 9 ) 需与蛋白质偶联后才能稳定地吸附于固相表面，从而获得重复性好的实验结果。此方法也可用于 I 和II 型肺炎球菌多糖与蛋白质的偶联，此时，多糖抗原的剂量应减少 5〜1 0 倍 。

材 料

指示液

氰尿酰氯结晶

0.1% ( m A O 多 聚 赖 氨 酸（相对分子质量 30 000〜70 000; Sigma)

III 型肺炎球菌多糖

PBS

1 . 取 3 支 试 管 ，标 记 为 A 、 B 和 C 。在 A 管 中 加 入 0.5m l 指示液•，在 B 管中加入0.5m g 氰尿酰氯结晶；在 C 管中加入 0.1 ml 0.1% (m /V ) 多聚赖氨酸。

2 . 用水将肺炎球菌多糖抗原稀释至 l m g /m l 。在 A 管 中 加 入 0.1m l 稀释后抗原，混勻IOs (溶液呈粉红色）。将 A 管中的液体移入 B 管 ，混 勻 IOs ( 当 p H 降 至 8.0〜8. 2 时 ，溶液变无色）。 然 后 将 B 管中的液体移入 C 管 。混勻后， 4 °C 结 合 2 h。

3 . 用 P B S 将肺炎球菌多糖抗原稀释至 2〜5 ug/ml (可 获 得 100 Mg 偶合抗原）。