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微生物快速检验技术进展

2019.4.16
 

人类进入21世纪,感染性疾患仍然是危害人类健康的重要疾患,尤其是对第三世界国家。WHO宣布近30年来,新发现了29种新病原体。Prion被确定为疯牛病和人类C-J等病的病原体,肯定了蛋白质颗粒可成为病原体,致使感染人类的微生物日趋复杂。常见致病微生物的威胁不但没有消除,且出现了严重的耐药问题,如葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、克雷白菌,给临床治疗带来巨大困难。HIV在世界范围内肆虐,STD病原微生物尚在蔓延。1993年,肺鼠疫在印度复燃,霍乱弧菌O139型有可能致成世界范围的第8次大流行。严峻的现实向微生物检验提出了更高的要求--更准确、更快速地检出与监测病原体。传统的微生物检验法的最大弱点是慢,难以适应诊断与治疗。近代,以PCR代表的分子生物学技术的发展及自动化仪器的应用已明显加快了微生物检验的速度,这些方面已有许多专著予以介绍。本文仅就微生物实验室可常规应用的技术即快速微生物检查法作一介绍。

一、 直接从临床标本中检查微生物抗原。Direct detection of pathogen's antigens or antibodies from patient's body fluids.
   应用单克隆抗体结合各种形式的放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)、化学发光免疫分析(CIA)、生物发光免疫分析(BIA)等,足以检出临床标本中痕量的(10-18-10-21)微生物抗原,免去细菌或病毒培养过程,直接完成微生物感染的快速诊断。应用斑点EIA、FIA或金标法已制成商品检测卡用于淋病奈瑟氏菌,沙眼衣原体、肺炎支原体等检测,快速、直观,可由患者自行检查,但敏感性与特异性尚存在问题。Gehring将单抗结合在磁珠上,自血液中吸附伤寒杆菌,再以免疫电化学发光法(ECM)检测,可以检出8×103/ml菌体,也有直接检出伤寒杆菌H或O抗原的报导。针对结合分支杆菌的表面抗原或脂阿拉伯聚糖(GAM)制成单抗,用ELISA或斑点EIA法可直接检测标本中的TB抗原。Brenda等报告用ELISA法可直接检测粪便中O157型大肠杆菌抗原,应用O157的多克隆抗体包被酶标板,加入适当稀释与处理的粪便标本后,再与过氧化物酶标记的抗O157抗体结合,加底物呈色。经与细菌培养法平行检查185份标本,阴性者9份,两法一致。此法与其他肠杆菌及非O157大肠杆菌无交叉反应。深部真菌感染的诊断极为困难,因自血液或体液中培养的阳性率很低。以敏感方法检查此类菌的可溶性抗原则可快速诊断,如念珠菌菌体成分中含D-阿拉伯醇和L-阿拉伯醇,自血液或体液中直接检出此种抗原,可迅速诊断深部念珠菌病。Mitsutake等比较了自39名深部念珠菌病患者血液中检出抗原的四种方法。应用斑点印迹法检查其弹力酶(Enolase)抗原的阳性率71.8%,特异性100% 。应用Latex凝集法(Cand-Tec试剂)检查热敏抗原阳性率76.9%,特异性87.5% 。应用Latex凝集法(pastrorex试剂)检查甘露聚糖抗原(Mannan)阳性率75.6%,特异性100% 。应用鲎试验检查真菌细胞壁组分β-Glucan的阳性率为84.4%,特异性为87.5% 。
  应用敏感手段自尿液中检出微生物的可溶性抗原进行快速诊断更具吸引力。国内已有SPA协同试验自尿液中检查军团菌可溶性抗原的报道。Hackman 比较EIA法检查尿中嗜肺军团菌血清型Ⅰ型抗原,其特异性均达100%,敏感性RIA为77%,EIA为88% 。自尿液检查B族链球菌可溶性抗原以诊断新生儿败血症,有应用特异性抗体的乳胶颗粒法和酶免法。不同商品试剂的敏感性达88-100%,特异性达81-100%,应用未浓缩尿的敏感性略低。应用ELISA直接自尿中检出沙眼衣原体,已有商品试剂盒出现(IDEIA-Ⅲ),自尿中测定念珠菌抗原D-阿拉伯醇以及D-阿拉伯醇/L-阿拉伯醇比值,可敏感的诊断播散性念珠菌病,比细菌培养法敏感、快速。检查尿中肺炎链球菌可溶性抗原(Binax公司)、尿中大肠埃希菌O157可溶性抗原(Binax公司)均为免疫层析金标记的检验卡。另外,检查尿中特异性抗体为诊断微生物感染开辟一新途径。IgG性抗体易于自尿中排除,应用敏感的手段可以检出。Irel and 等报告了应用ELISA法检查尿中A型流感病毒IgG抗体来诊断流感患者。国外报告自尿中检查抗HIV抗体,检查2599例与血清中抗HIV不符合者仅2% 。
  自粪便中检查微生物抗原,为胃肠道致病菌的检查开辟一新的途径。应用EIA 法(Meridian Diagnostics公司试剂)检查粪便中的幽门螺杆菌抗原,PCR比较的特异性达94.6%,敏感性达88.9%。国内也有类似的报道。

 


   直接自患者咽拭或痰标本检出呼吸道病毒及肺炎支原体已有很大进展。我们应用单克隆抗体结合硝纤膜上的斑点EIA技术,已成功地自患者的咽拭标本中同时检出可能存在的肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和3、7型腺病毒。也有应用单克隆抗体APAAP染色技术以及FIA同时检出多种呼吸道病原体的报道。这些快速手段,利于及时鉴别细菌性、病毒性或肺炎支原体性的呼吸道感染而有针对性地合理使用抗生。
   直接自脑脊液中EIA法检查肺炎链球菌的teichoic Acid 或Lipo taichoic Acid 可快速诊断肺炎链球菌性脑膜炎。

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