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―、材料与设备
1. HeLa 细胞核提取物的制备
(1) 悬浮培养的 HeLa 细胞。
(2) PBS-Earle：130 mmol/L NaCl，20 mmol/L K2HPO4 / KH2PO4 ( pH 7.4）。
(3) 缓冲液 A：10 mmol/L HEPES-KOH（pH 8.0），10 mmoI/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L 1，4 二硫赤藓醇 ( DTE )。
(4) 缓冲液 C：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )， 420 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF），0.2 mmol/L EDTA（pH 8.0），25% ( V/V) 甘油。
(5) 缓冲液 G：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，150 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mol/L PMSF，5% ( V/V）甘油。
(6) 40 ml Dounce 匀浆器和松紧合适的 S 型研杵。
2. 甘油梯度离心
(1) 缓冲液 C：20 mmol/L HEFES-KOH ( pH 8.0 )，420 mmol/L NaCl，1.5 mmoL/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L PMSF，0.2 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
(2) 缓冲液 G：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，150 mmol KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L PMSF，5%（V/V）甘油。
3. 采用抗 m3G 免疫亲和层析纯化 U 系列 snRNP
(1) 抗 m3G 免疫亲和层析柱：把约 7 mg 抗 m3G 的 IgG（Euro-Diagnostica，Arnhem，The NetherUmds ) 按照 Pharmacia 公司提供的标准方法结合到 1 ml 经 CNBr 激活的 Stpharose 凝胶上。
(2) 缓冲液 C：20 mmol/L HEPES-KOH（pH 8.0），420 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF)，0.2 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )，25% （V/V）甘油。
(3) 缓冲液 C( 低）：除了用 5% 甘油外，其余成分同缓冲液 C。
(4) 缓冲液除了 NaCl 浓度为 250 mmol/L 外，其余成分同缓冲液 C（低）。
4. 用 Mono Q 层析法纯化 U1 snRNP
(1) 缓冲液 Q-0：20 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.0)，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE 和 0.5 mmol/L PMSF。
(2) 缓冲液 Q-50：缓冲液 Q-0 中加 50 mmol/L KCl。
(3) 缓冲液 Q-1000：缓冲液 Q-0 中加 1000 mmol/L KCl。
(4) 1 ml Mono Q 阴离子交换柱（Pharmacia）。
5. [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 复合物的纯化
(1) H386 单克隆 IgG 抗体的免疫亲和柱（Euro-Diagnostica，Arnhem，The Netherlands）。
(2) H386 抗体表位，序列为 DRDRERRRSHRSERERRRDRDKDRURDREHKR 的 32 肽，可按标准方法合成。
(3) 缓冲液 G：20 mmol/L HEPES KOH ( pH 8.0 )，150 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCI2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L PMSF，3% ( V/V ) 甘油。
(4) 磷酸盐缓冲液：10 mmol/L 磷酸钠（pH 7.2 )。
6. 17S U2 snRNP 的纯化
(1) 抗 m3G 免疫亲和层析柱：同前。
(2) 缓冲液 G：同前。
二、操作方法
1. HeLa 细胞核提取物的制备
(1) 在 D MEM 培养基中 37℃ 悬浮培养 HeLa S3 细胞，培养基中加有 5% 新生小牛血清、50 μg/ml 青霉素，100 μg/ml 链霉素，对数生长期时细胞密度保持在 2.5X105~5X105/ml。为了获得足够的 U snRNP，细胞数应该达到 5X109（相当于培养 8~10 L 细胞）。
(2) 在 4℃ 1000 g 离心 10 min 收集细胞。
(3) 每 109 个细胞用 20 ml PBS-Earle 重悬，然后采用 1000 g 离心 10 min 收集细胞。
(4) 估计细胞沉淀的体积，用 5 倍体积的缓冲液 A 重悬。
(5) 让细胞膨胀 10 min，再按步骤 (3) 的方法离心，然后用 2 倍体积的缓冲液 A 重悬。
(6) 用 Dounce 匀浆器匀浆 10 次破碎细胞。
(7) 用 SorvalI SA1：转子连续离心两次去除细胞质；1000 g 10 min 然后 25000 g 20 min。
(8) 用缓冲液 C 重悬沉淀，每 105 个细胞用 3 ml 缓冲液 C。
(9) 用 Dounce 匀浆器匀浆 10 次破碎细胞核。
(10) 把剩下的悬浮物转移到烧杯里，用磁力搅拌器在冰上轻轻搅拌 30 min。
(11) 25000 g 离心 30 min 去除核膜。
(12) 剩下的上清就是在高盐（420 mmol/L) 条件下得到的胞核提取物。提取物在液氮中速冻后可在 -80℃ 保存。
为得到有剪接活性的胞核提取物，可用 100 倍体积的缓冲液 G 透析 4~5 h，使其盐浓度为 150 mmol/L，用这种方法制备的细胞核提取物在占到最终反应体积的 40%~60% 时是具有剪接活性的。5X109 个细胞可得到约 18 ml 的低盐细胞核提取物。
2. 甘油梯度离心
根据
snRNP 的大小不同，可以用甘油密度梯度离心来分离不同种类的 snRNP。用密度梯度离心初步分级分离胞核提取物吋以显著提高获得的 snRNP
的纯度。在采用密度梯度离心初步分离 17S U2 snRNP 和 25S [ U4/U6、U5 ] 聚 snRNP 时应该采用较低 的盐浓度。
(1) 在无菌的 SW 28 管中用缓冲液 C ( 高盐梯度）或缓冲液 G ( 低盐梯度）于室温制备 10%~30% 的线性甘油密度梯度。
(2) 在 4°C 静置至少 1 h（最好过夜），使每个密度梯度内部达到平衡。
(3) 用移液器小心地将胞核提取物加至密度梯度上，30 ml 的 SW 28 密度梯度柱能上 8 ml 的提取物。
(4) 用低加速度于 2700 r/min（105 g）离心 17 h。终止离心时不要用制动。
(5) 用自动分级分离装置收集各梯度，也可以用 Eppendorf 移液器每 1.5 ml —份从顶到底手工收集。
(6) 取每一部分的 1/10，酚：氯仿抽提后再用乙醇/乙酸钠沉淀获得 RNA。采用凝胶电泳并通过标准的银染分析各部分的 U 系列snRNP。
3. 用抗 m3G 免疫亲和层析纯化 U 系列 snRNP
(1) 用 5 倍体积的缓冲液 C 洗柱，平衡抗 m3G 的免疫亲和柱。至少应有 5 ml 的柱体积才能有效地结合 15 ml 的胞核提取物中的 U snRNP。
(2) 以 1.5 ml/h 的速度将高盐条件下得到的胞核提取物过亲和层析柱。
(3) 用 6 倍柱体积的缓冲液 C ( 低）洗脱非特异性结合的成分。
(4) 用 2 倍柱体积的 15 mmol/L 核苷洗脱特异结合的 U snRNP。m3G
可以溶解在高盐缓冲液 [ 缓冲液 C ( 低）] 或中等浓度的盐溶液（缓冲液 F )。如果采用缓冲液 F， U4、U5、U6 snRNP
将会以 [ U4/U6、U5 ] 聚 snRNP 复合物的形式被洗脱下来、15 ml 的胞核提取物中可以分离到约 4 mg 的 U
snRNP。snRNP 在液氮中速冻后，可在 -80℃ 保存。
(5) 用 1 倍柱体积的 6 mol/L 尿素 [ 溶在缓冲液 C( 低）中 ] 洗柱，可以洗掉抗体结合的 m3G。
(6) 用 20 倍柱体积的缓冲液 C ( 低）冼柱可以再生亲和层析柱，若要长期保存则应加入终浓度为 0.02% ( V/V ) 的 NaN4。
4. 用 Mono Q 层析法纯化 U1 snRNP
(1) 用 20 倍体积的缓冲液 Q-1000 清洗层析系统。
(2) 用与步骤 ① 同样体积的缓冲液 Q-50 洗柱并平衡。测定 280 nm 光吸收值并以此值作为零点。
(3) 用缓冲液 Q-0 稀释通过抗 m3G 免疫亲和层析获得的 U snRNP，使一价离子的浓度低于 200 mmol/L。
(4) 把 U snRNP ( 1~40 mg ) 上到 Mono Q 柱中，流速为 2 ml/min。压力不应超过 3.0 MPa。
(5) 用缓冲液 Q-50 洗柱，直至光吸收值为零 ( 通常需两倍柱体积）。
(6)
以 1 ml/min 的流速洗脱 snRNP，通过编程 FPLC 控制器来控制 KCl 的浓度梯度。开始 KCI 浓度为 50 mmol/L (
缓冲液 Q 50 )，然后在 4 min 内每分钟增加缓冲液 Q-1000 5.4%，接着 30 min 内每分钟增加 1%，然后 10
min 内每分钟增加 4.2%。最后用 缓冲液 Q-1000 洗 4 min。洗脱过程中，按 1 ml 每份收集。U1 snRNP 的洗脱在
KCl 浓度为 350~370 mmol/L 时达到第一个高峰。
(7) 通过测 280 nm 光吸收值的方法来确定每份收集液中 U1 snRNP 的浓度（I A280 单位相当于 0.35 mg/ml），用 PAGE 的方法分析 RNA 和蛋白质成分。
(8) 12S U1 snRNP 中污染的 20S U5 snRNP 可进一步通过甘油密度梯度离心分离。
5. [ U4/U6、U5 ] 二聚 snRNP 复合物的纯化
可以用两种方法来分离
[ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 复合物。第一种方法是用甘油梯度离心分离由帽特异抗体免疫亲和层析得到的总
snRNP，这种方法操作较快，产出较高， 但三聚 snRNP 的纯度较低。第二种方法则是用 H386 抗体进行免疫亲和纯化，这种抗体是采用 U1
snRNP 特异 70 kDa 蛋白制备的，但它对 [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 复合物中的一个 100 kDa
蛋白也有强烈的交叉反应。这种方法得到的 [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP
相对较纯，但较第一种方法麻烦，产出率也低。下面将简单介绍第二种操作方法。
(1) 合并由甘油密度梯度离心分离到的 25S 的细胞核提取物，并以 1 ml/min 的流速通过 H386 免疫亲和层析柱。2 ml 柱体积的亲和柱最多可上 7 ml 细胞核提取物，相当于 4 份收集物，约含 100~150 μg U snRNP。
(2) 以 20 倍柱体积的缓冲液 G 洗掉非特异结合的成分。
(3) 用 5 倍柱体积的含 0.01 mmol/L 相对于 H386 主要抗原表位的竞争性 32 肽的缓冲液 G 洗脱特异结合的 U snRNP。每份收集 400 μl，取其中 1/10 用标准方法分析 RNA 和 蛋白组分。
(4) 如果有必要，可用前面介绍的甘油梯度离心法分离与 25S [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 共洗脱的微量 12S U1 snRNP。
(5) 先用 5 倍柱体积的磷酸盐缓冲液（10 mmol/L 磷酸钠，pH 7.2 ) 洗脱，再用同样体积含 3.5 mol/L MgCl2 的相同缓冲液洗脱，以洗脱与抗体结合的多肽。
(6) 用 10 倍柱体积的缓冲液 G 洗涤，使亲和柱再生。若要长期保存则应加入终浓度为 0.02% ( V/V ) 的 NaN3。
6. 17S U2 snRNP 的纯化
要得到含完整蛋白组分的 17S U2 snRNP 非常困难，这是因为当盐浓度超过 200 mmol/L 时 U2 特异蛋白大多从 U2 snRNP 上分离，而且在 17S 的 U2 snRNP 中抗体也很难与 U2 RNA 的 m3G
帽结合，因此在用帽特异结合抗体免疫亲和分离 17S U2 snRNP
之前，所有的实验操作都要在低离子强度下进行，而在纯化前应该去除大部分有良好外露帽结构的
snRNP。当从胞核提取物中分离时，应该先用甘油梯度离心获得 17S U2 snRNP 的预分离物。
(1) 合并由甘油密度梯度离心得到的组分。用 H386 免疫亲和层析柱去除少量的 12S U1 snRNP、U5 snRNP 和 [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP。
(2) 把含 17S U2 snRNP 的流出液上到抗 m3G 的免疫亲和层析柱中。
(3) 用 20 倍柱体积的缓冲液 G 洗脱非特异结合的物质。
(4) 按程序 2 “甘油梯度离心” 中介绍的方法采用 m3G 洗脱 17S U2 snRNP 并进行分析。
(5) 按程序 2 “甘油梯度离心” 的步骤 (3) 的方法再生亲和柱。
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