分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

菌落 PCR 分析克隆的重组体实验

2019.9.12

实验方法原理	菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。使用载体上的通用引物，进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。
实验材料	菌落
试剂、试剂盒	溴化乙锭 Taq 延伸 PCR 添加剂 Tween20 10% 溶液dNTP 溶液 PCR 缓冲液热稳定 DNA 聚合酶引物
仪器、耗材	无菌枪头琼脂糖凝胶电泳设备和试剂
实验步骤	一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂溴化乙锭 Taq 延伸 PCR 添加剂（Stratagene) Tween20，10% 溶液 2. 酶和酶缓冲液 dNTP 溶液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 25 mmol/L) PCR 缓冲液，10X, 用户买热稳定聚合酶时公司一并提供，或者 PCR 优化缓冲液，比如，Opti-Prime PCR 优化试剂盒（Stratagene)，以及 PCR Optimizer(Invitrogen) 热稳定 DNA 聚合酶（5~10U)，比如，Taq DNA 聚合酶，克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene) 3. 核酸和寡核苷酸可选择：插入物特异的引物（在双向克隆中用来确定插入物的方向）一套筛选重组体的引物 4. 专用设备用于划板和接菌的无菌枪头用枪头代替牙签，是因为牙签可通过毛细作用带走液体，因此会改变反应混合物的浓度。 5. 額外项目琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭二、方法 1. 根据反应数目或要做的 PCR 反应的管数，在冰上用一个离心管像调鸡尾酒一样准备 PCR「鸡尾酒」式混合物，按如下顺序依次加入各种成分。 H₂O 将终体积补充到 25ul Taq 缓冲液，10X 2.5ul Tween20(体积分数 10% 溶液） 1.0ul dNTP 混合物（每种 dNTP 为 25 mmol/L) 0.2ul 重组体筛选引物套（100ng/ul) 1ul Taq 延伸 PCR 添加剂（5U/ul) 0.25ul Taq DNA 聚合酶（5U/ul) 0.25ul 2. 在冰上，分装"鸡尾酒"式 PCR 混合物到每一个 PCR 试管中，每管移取 25ul。 3. 对照反应中，加入 1ul 的非重组 DNA。可以选择：对于用来确定插入方向的反应，向恰当的反应管中加入第三个插入物特异的引物。 4. 对于重组筛选，用一个无菌枪头刺挑一下转化后长出的菌落，然后在相应的反应管中搅动菌落物质。在给每一个反应混合物接种后，迅速地移走枪头，并在含有抗生素平板上轻涂以留菌种，以备后续分析。对于 PCR 介导的重组筛选，也可参考下面的疑难解答。 5. 轻轻混匀每个反应体系。 6. 用推荐的循环参数进行 PCR。 7. 用标准的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。推荐用 10~15 g/L 琼脂糖凝胶来优化分辨500~6000bp 的 PCR 产物。通常，取 1~5ul PCR 产物经溴化乙锭染色后分析。可以通过传统的瞬间成像技术或计算机图像软件来获取图像。展开
注意事项	1. 设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。 2. 使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。展开
其他	牙签可通过毛细作用带走液体，因此会改变反应混合物的浓度。