高速Maldi成像：优化药物研究中的样品分析时间（一）
在过去的几十年中，MALDI-TOF质谱（基质辅助激光解吸/电离飞行时间）已在大量应用中证明了它的有效性和稳健性，并帮助生命科学家应对了最严峻的挑战。诸多公司和学术机构依靠诸如MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF质谱系统等仪器来加速其研究。病理学、生物标志物研究、药物表征等领域的科学家，试图对肿瘤异质性进行描绘，并将这些信息与疾病结果联系起来。基于蛋白质分布的组织成像仍然是应对这一挑战的最强大的分析技术之一。
本文将重点讨论新的激光技术是如何提高MALDI成像的样本通量的。它将揭示MALDI技术作为一种成熟的技术是如何在药物开发中应用于化合物分布分析，以及作为一种新兴工具如何提高药物发现过程的效率，特别是应用于超高通量药物筛选中。
当前的挑战
MALDI成像是一种空间分辨、无标记分析技术，可直接对生物样品进行分析。而采集速度和样品通量是质谱成像（MSI）实验中的限制性因素，特别是在临床研究中。因为临床研究需要分析大量患者的样本，以消除个体差异。利用质谱成像进行临床导向的转化医学研究严重依赖于分析速度以及稳健的操作。当前仪器存在的局限性限制了它的充分应用。必须突破这种局限性，才能使科学家能够更好地从事高通量的临床研究。
采集速度也是高空间分辨率的MSI实验的制约因素，特别是对于较大组织切片的分析。新的MALDI成像解决方案标志着在生产力、经营成本和易用性方面的范式转变，使质谱成像成为个性化医学研究的强大而可靠的信息源。
创新的MALDI分析技术
MALDI在制药环境中具有广泛的适用性。如今，这种离子化技术被用于超高通量筛选、吸收、分布、代谢和排泄（ADME）应用中的先导化合物发现，以及生物制药的质量控制，或被用于临床微生物鉴定等生物/临床诊断。以上这些应用都对包括速度、结果分析时间、通量、易用性、明确性和稳健性等有很高的要求。
仪器市场正在积极响应并解决科学家关于提高样品通量并提高数据质量的需求，以帮助他们在最短的时间内做出最好的决定。新的质谱成像解决方案重新定义了MALDI成像的关键性能指标，成像速度比传统MALDI-TOF系统提升了10倍，且同时不会损失灵敏度。
化合物分布分析
虽然MALDI成像分析应用涵盖范围很广，但其共同点都是评估 分子在不同组织类型中的空间分布。MALDI成像是一种可直接从组织切片中检测潜在的生物标志物的分析技术，它在过去的十年中得到了普及。针对酶解产物空间分辨的实验流程的优化成为研究热点。最重要的是，对临床病理学中最常见的样品类型 — 福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的病理组织，可通过原位酶切实现对FFPE组织中的肽的分析。此外，它还能使用肽作为替代物来对较大的蛋白质进行检测，并借助MS/MS来促进生物标志物的鉴定。
传统仪器的采集速度仅为2像素/秒，漫长的仪器运行时间成为制约成像实验的瓶颈和挑战。如果常规研究中样品数目不止一个，就将很快会达到仪器运行的极限。此外，空间分辨率的提高意味着单位面积像素数目的增加以及像素直径倒数平方值的增大。所以，无论是将科学成果进行常规化应用，还是应对在更高空间分辨率下减少激光光斑大小的需求，更高的采集速度都是必须的。
此外， MALDI成像具有的更高的分子特异性也是非常有益的。现在正在探寻利用高分辨和MS/MS采样模式来实现高的分子特异性，这要求仪器具有更快的数据采集速度，尤其是在MS/MS模式下依然保持这样的数据采集速度。
图1显示了MALDI MS/MS模式下成像采集的一个实例，它显示了在利用胰蛋白酶原位酶解组织切片后的的肽段ARTKQTAR在组织上的分布。值得注意的是，在空间分辨率为30μm的情况下，采集全部32000个像素仅花费33分钟。采集时间只有原来的5-10之一，使整个实验能在一个工作日内完成。它提供了一个可用来评估并优化原位组织酶解方案的强大工具。
图1：H33_小鼠的肽ARTKQTAR的MS/MS质谱成像图（母离子m/z: 931.54 Da -> [b+18] 碎片 m/z 775.4 Da）
质谱成像解决方案 - 数据示例
以下实例来自新一代MALDI-TOF样机的初始数据，它能在10μm及以下像素尺寸下达到每秒50像素（图谱）的采集速度。所示数据来自最常见的MSI应用领域，包括脂质、肽和完整蛋白质分析。
方法
样品制备和基质应用是参照以前公布的标准程序进行的。在脂质和完整蛋白质分析中，将10μm厚的新鲜冷冻组织切片安放在导电载玻片上，并用自制升华装置将DHB基质沉积在组织表面。对于蛋白质，当基质沉积后，在恒湿试验箱中用乙酸（5%）进行额外的再水化步骤。而在肽分析中，则将FFPE组织薄切片（4μm）安装在载玻片上。依据标准操作流程，对样品进行石蜡去除和抗原修复（Tris缓冲液，pH 为9）之后，使用ImagePrepTM 装置（Bruker Daltonik GmbH，德国不来梅市）对样品进行酶解并涂覆HCCA基质。所有MS成像数据都是在Bruker的新一代MALDI-TOF仪器（rapifleX MALDI TissuetyperTM）的样机上采集的。该仪器是配备新型10kHz smartbeamTM 3D激光器，具有线性/反射模式，而该激光器使用经过优化的激光束聚焦透镜产生窄聚焦（<5μm直径）高斯分布的激光斑点。结合一组旋转镜片，激光斑点可以快速精确地定位在样品上，从而实现真正的方形像素。
结果
基于MALDI-TOF的组织成像的三个主要应用领域的初始数据如图所示，其主要差异在于样品制备和所分析的m/z范围。
·脂质分析（约500-1,500 m/z）通常以小像素进行，以达到最高的空间分辨率（图2）。
·完整蛋白质分析（约2,000-20,000 m/z）。由于MALDI离子的低电荷状态和其它类型分析器的质量截留效应，通常采用MALDI/TOF仪器，如rapifleX MALDI Tissuetyper（图3）。
·（胰蛋白酶解）多肽分析（约500-4,500 m/z）是获取FFPE组织信息的主要途径。通常酶解步骤限制了空间分辨率（图4）。
该平台的性能基于以下标准：
·以高采集速度和高空间分辨率生成一致的、带空间信息的图像。
·在激光照射后仍能保留组织完整性，以便随后的常规组织学检测。
·在数据采集中和采集后，在合理的时间内，具有对大型MSI数据集处理、分析并可视化的分析能力。
