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专家指南：如何研究基因调控（三）
Q5：在定位蛋白-DNA相互作用时，为降低DNA污染和片段化所引起的假阳性，同时也避免太严格的数据过滤所引起的假阴性，您的主要方法是什么?
Marc Facciotti(加州大学戴维斯分校)：
首先，从微生物的角度来看，我们选择对天然表达的转录因子开展ChIP实验。我们认为，这能够将与过表达质粒相关的假阳性降至最低。第二，我们不会完全相信任何自动化的峰检测算法。我们的策略是建立我们自己的自动化峰检测工具，它让假阴性降至最低，代价是一些假阳性峰也会被报告。随后，我们手动组织峰列表，避免明显的假阳性。这听上去似乎很耗时，但对于小的微生物基因组并非如此。与后面追踪和验证假线索所浪费的时间和头痛相比，前面花费的时间是值得的。
Kun Huang(俄亥俄州立大学)：
根据我的经验，关键是样品/文库制备步骤，我们与生物学家密切合作，以了解QC过程。根据我们对多个实验的观察，交联和超声处理步骤很关键，但没有得到足够的重视。与ChIP-PCR或ChIP-chip等方法不同，其中的污染或“坏”片段不会被扩增或测定，ChIP-seq将受到这些步骤的严重影响。因此在测序之前需要小心控制片段大小。
对于文库中已经被测序的潜在污染，污染来源(如病毒)常常有着小的基因组，倾向于高度扩增。因此必须从原始数据中去除过度重复的序列。此外，有时候它们无法定位到参考基因组，因此明显降低定位率。在某些情况下，通过Blast高度重复的序列，我们可检测污染的来源。
Jason Lieb(北卡罗来纳大学教堂山分校)：
免疫沉淀应当在封闭试剂(如BSA)存在时用经过验证的抗体来开展。最近Frank Pugh实验室开发出一种新技术ChIP-exo，无疑将提高信噪比。
Xiaole Shirley Liu(Dana-Farber 癌症研究所)：
在研究蛋白-DNA相互作用时，ChIP-seq是最好的方法。DNA污染不是个大问题，但抗体质量会大大影响最终的数据质量和噪音水平。片段化(如超声条件)也有影响。抗体的质量控制、一致的步骤和生物学重复是确保数据质量的最好方法。分析方法也很重要。峰检出程序(如MACS)提供了每个的 ChIP-seq检出峰的倍数变化、p值和FDR。
Jun Song(加州大学旧金山分校)：
我们使用对照DNA的测序数据，以便对细胞类型特异的背景噪音和偏向进行建模。我们还通过分离基因组区域，开展多个样品的标准化，这些区域包含来自背景区域的生物学信号。我们使用不同的回归模型和随机过程的思路，过滤掉偏向和假象。
Q6：在ChIP-seq/ChIP-chip数据分析时，您首选的计算工具是什么?
Marc Facciotti(加州大学戴维斯分校)：
我不能说哪个最喜欢。我们建立了内部的峰检测软件，它能够处理一些古怪的基因组。我们用custom R和Python scripts及其他现有的工具分析产生的峰列表。
Kun Huang(俄亥俄州立大学)：
我们发现，在进行转录因子的常规分析时，商业化的软件(如Partek)非常有用。然而，我们一般使用两种或三种其他的峰检出软件包(MACS、 HOMER、SISSR)，来检查峰检测的一致性。对于长的区域，我们使用内部开发的算法。我们应用多种方法来寻找motif，包括鉴定已知的 motif，并通过ChIP-Motif等工具进行de novo motif发现。Partek motif分析工具也十分有用。
Jason Lieb(北卡罗来纳大学教堂山分校)：
对于ChIP-seq数据，我们一般使用ZINBA，对于ChIP-chip数据，我们用MA2C。
Xiaole Shirley Liu(Dana-Farber 癌症研究所)：
我们最喜欢Cistrome和CisGenome。
Kevin White(芝加哥大学)：
这是个快速发展的领域。我们今天所用的可能并不是明天所用的，因为峰检出的方法在不断改进。然而，我们现在正与斯坦福的Mike Snyder研究小组合作，重新分析来自modENCODE计划的人、果蝇、蠕虫和小鼠的ChIP-seq数据，以便为利用BWA和SAM工具进行比对和质量控制、MACS2进行峰检出和IDR进行重复性分析的研究人员提供标准化的数据集。
