验动物内耳基因导入研究进展
半世纪来，科学家们假设外源DNA介导的基因改造技术可能成为对人类遗传疾病的一种有效治疗手段，虽然将理论运用于临床实践的过程漫长而曲折，但基因治疗已经成为攻克遗传性耳聋的一项崭新治疗模式而充满希望。从内耳的解剖特点看,由于耳蜗骨迷路和内耳血迷路屏障的存在，耳蜗成为一个相对独立的器官,为内耳基因治疗提供了理想环境[1]。内耳基因治疗领域正在快速发展，随着不同的新型载体的发现以及耳聋遗传学动物模型研究的逐渐增多，国内外开展的内耳基因导入研究也逐渐增多，但研究的关注点多在外源基因在宿主细胞的转染率，以及基因表达的分布，而较少的关注导入手术前后听觉功能的变化及保护。因此，探索一种转染效率高，同时又能较好地保护患者听力的基因导入技术十分有必要。
目前内耳基因的导入途径分为两种:听泡内途径和听泡外途径。其中听泡内途径包括经圆窗途径和圆窗外途径。前者有：经圆窗显微注射，圆窗龛明胶海绵+介质粘贴等途径；后者有：鼓阶切开，前庭阶切开及中阶切开等途径。听泡外途径包括后半规管切开，内淋巴囊途径及听泡外鼓阶显微注射等途径。而其中的内淋巴囊途径和中阶注射切开途径属于内淋巴导入，其余为外淋巴导入[2]。本文将从近年来国内外对于内耳基因导入的研究中回顾有关内耳手术入路与听力保护相关的资料，从而比较经圆窗途径、耳蜗开窗、半规管途径等的转染率及听力保护差异。
1 圆窗途径
1.1 完整圆窗膜渗透导入法
圆窗膜途径是一种低侵入性载体导入技术，被认为是从中耳传递潜在毒性物质到内耳的主要途径。临床上，如：向内耳导入激素，庆大霉素已被用于治疗突发性耳聋以及治疗梅尼埃病相关的眩晕。
该途径的优点是：1.未损伤耳蜗结构，基本不造成内耳炎症及损伤。2009年Chen通过完整圆窗膜渗透法向豚鼠导入以重组腺病毒为载体的Math1基因，发现完整圆窗膜实验组外毛细胞点状缺失，转导成功率为50%，术后听力与术前比较无差异。耳蜗形态学研究显示该方法不会导致中耳及内耳，尤其是圆窗膜的炎症和破损[3]。2014年Cheng进一步验证该方法是微创，安全的[4]。2.能成功转染载体到耳蜗导管附近耳蜗组织，螺旋神经节细胞及毛细胞，听觉功能保护良好。2001年Jero从小鼠完整圆窗膜渗透导入脂质体复合物，在小鼠导入耳同侧的螺旋缘，螺旋神经节细胞及前庭膜发现有表达[5] 。Jero将脂质体载体和腺病毒载体(腺相关病毒则无效)转导入小鼠的耳蜗时，成功地将外源基因通过完整的圆窗膜导入耳蜗组织中并得到表达[6]。
其缺点则是：1.载体导入具有病毒选择性。如2001年Jero在向小鼠耳蜗导入腺病毒时引起了圆窗膜水肿，作者认为早期的水肿有增加圆窗膜渗透性的可能，然而长期的水肿必然引起圆窗膜的增厚及局部炎症反应，影响载体的导入。因此选择适宜类型的病毒或者非病毒性载体十分重要。2.载体的分布表达不均。如2015年Wang运用纳米级别的复合物颗粒制作基因载体，成功经圆窗膜渗透途径导入豚鼠耳蜗，其中毛细胞的表达如下：底转外毛细胞81.7±4.71%，中转可达33.8±9.02%，内毛细胞只表达在中转以下，且仅为8.9±1.85%。其他研究数据均发现底转表达较多，顶转表达较少，存在分布不均的现象[7]。
综上所述，该途径侵入性低，是一种理想的导入手段，其研究重点是选择更具靶向性，分子量小，对细胞毒性小，转染效率高的载体。以及探索新的渗透剂量，浓度和速度，使表达分布更加均匀。
1.2 圆窗膜注射法
圆窗膜注射法是经耳蜗的天然入口通往鼓阶的一种入路，可以保护听力，有较高的转染效率和较少的耳蜗损伤和听力损失。但真实的转染效率与听力保护结果与实验注射设备选择，液体导入体积，导入速度，及术后组织覆盖，是否发生外淋巴瘘有关。同时，圆窗膜注射法也是应用最广的一种导入途径。
其优点是:1.转导率较高:2003 年Praetorius 等用腺病毒( Ad5)，经圆窗膜显微注射方式导入小鼠耳蜗，术中使用立体固定架固定头部，用36号针头注射。发现导入后24小时GFP在螺旋韧带、内毛细胞、螺旋神经元上有很强的表达，外毛细胞相对较弱[8] 。而2009年Xu同样经圆窗膜向小鼠耳蜗导入Ad-EGFP，术后出现听力丧失。分析原因可能有两点:一是损伤圆窗膜且填塞圆窗龛(防止外淋巴漏)，影响两窗相位差从而影响术后听力；二是显微注射后可能发生前庭膜破裂，也是术后听力丧失的一个重要原因[9]。
2. 表达的均匀程度较高:如2015年Akil等从圆窗膜穿刺，用腺相关病毒1 型(AAV-1) 运载VGLUT3基因(AAV1-VGLUT3)导入新生小鼠耳蜗,实验结果表明转染基因表达在内毛细胞，外毛细胞和支持细胞，认为其转染率和表达的均匀程度较高, 未造成明显的Corti氏器损伤。并且持续时间长达1年半，这与其他动物模型和其他器官系统的表达时间一致，避免了耳蜗细胞的损伤[10] 。该实验在进行注射前先刺破圆窗膜至未见有液体流出时再进行导入，可能这种释放淋巴液的方法有一定的平衡液体压力的作用。2017年Shi等通过圆窗膜导入AAV1，并观察其在小型猪及豚鼠耳蜗内的表达。发现AAV1在二者毛细胞中均有表达,在小型猪上，2、3、4 周的表达率分别为12.00 ± 5.72%，66.50 ± 4.65%，48.25 ± 3.77%。3周时在内毛细胞中均匀表达。2、3、4 周在内毛细胞，Hensen’s 细胞，内柱外柱细胞，螺旋韧带，螺旋缘及前庭膜上均发现表达。在豚鼠上第2周开始出现在毛细胞的整个底回区域，表达率为84.60±4.56%(达到峰值)，3周为63.40 ± 3.21%[11]。此外，2012年Shibata认为圆窗膜注射在透明质酸(HA)的作用下使得转染的覆盖面比耳蜗开窗术更广，并且在不伴有耳蜗内液体自然稀释的作用下通过HA的作用下实现主动分布[12]，这种作用在Bjurstro ̈m 的文献报道中推测是在圆窗膜上增加了液体的渗透压。以及增加了膜的渗透性，以及HA本身的高粘度使得试剂与圆窗膜有长时间接触的过程有利于注射物的转导[13] 。
2 耳蜗开窗术
2.1 鼓阶开窗
理论上来说，在Corti 器中，科蒂淋巴成份与外淋巴相似，通过缰孔及骨螺旋板中的小孔与鼓阶中的外淋巴相通。毛细胞顶部表皮板与内淋巴接触，其他部分浸浴在科蒂淋巴中并由其供应营养。这种结构构成了经鼓阶外淋巴导入外源基因在Corti 器上得以表达的解剖学基础。
其缺点包括：1. 鼓阶打孔造成的底回淋巴液波动对应于听力高频部分，鼓阶开窗有较大可能损害高频听力。2007年Kanzaki提出腺病毒相关的神经胶质细胞源性的神经营养因子的鼓阶注射，在鼓阶注射后在4kHz和8kHz处ABR升高约30dB SPL，在16kHz处为超过40dB SPL[14] 。2009年Chen Wei在探索Math1基因的内耳导入径路时，实验组及对照组可见片状外毛细胞缺失，内毛细胞个别缺失。ABR在8kHz时较术前升高，16kHz，20kHz较术前明显升高。作者认为这种损伤主要是手术操作造成的，机理可能为，耳蜗鼓阶打孔以及病毒悬液的注入引起了耳蜗底回外淋巴液的强烈波动，对应于听力高频部分(16 kHz，20 kHz)，低频阈值升高的现象有可能是病毒的生物毒性和免疫反应造成的[3] 。为加强对听力的保护，2009年李利等运用微量注射器及微量泵向小鼠耳蜗鼓阶导入胚胎干细胞5ul，发现胚胎干细胞可经耳蜗底转鼓阶打孔途径导入耳蜗，干细胞在内耳成功存活，并且对内耳损伤小(术前、术后阈移10dB SPL左右)[15] 。2011年Kilpatrick认为在向鼓室注射人工外淋巴液时当注射速度在16-32nl/min的区间时能提供好的听力保护结果[16]
2.存在导入载体分布不均的现象. 2012年Shibata在实验中发现通过耳蜗底转的鼓阶注射后，转基因表达eGFP分布受限，主要是在前两回的鼓阶，更高回表达的缺乏可能是由于外淋巴的“逆流”以及脑脊液由于向缺口流动造成的阻力[12] 。2013年Wei总结通过圆窗膜运用微型注射器或者泵将半病毒载体泵入耳蜗鼓阶，载体的表达受限于鼓阶和前庭阶的内壁细胞，在Corti器及螺旋神经节处未发现表达[17]。
综上所述，鼓阶打孔的基因导入方式会引起ABR 10dB SPL左右的阈移，降低载体导入体积和导入速度可一定程度上保护听力。如何选取与内外毛细胞更亲和的表达载体及浓度，提高内外毛细胞转染效率，精确控制载体导入体积和速度是研究的重点。
2.2 中阶开窗
相对于经鼓阶外淋巴导入表达载体，中阶内淋巴导入对于接触内外毛细胞更为直接，听力损伤则大于鼓阶。
其优点是：有较高的细胞转染效率。2007年Kanzaki指出病毒通过内淋巴及中阶的外侧壁进入到感觉上皮细胞，螺旋神经节细胞及血管纹细胞。载体可能通过螺旋神经节形成的神经的缰孔进入神经。从中阶导入豚鼠内耳的途径特别适用于螺旋神经节细胞[14]，2016年Shu等向新生小鼠中阶导入腺病毒GFP载体，发现所有种类的腺病毒在不同日龄均在底转和中转的螺旋神经节细胞有表达，其中Ad-GFP-Baylor 组在P0转染率最高，底转、中转分别90.8±9.2，84.7±10.6，耳蜗各转内毛细胞，外毛细胞，螺旋神经节细胞均有不同组病毒不同程度的转染，作者认为向小鼠中阶导入载体可提高转染效率。
其缺点最显著的是造成听力损失较大，听力测试显示中阶注射组的听阈高于鼓阶注射组。可能的原因有：1. 向该处注射过多体积的载体于内淋巴可能会引起机械损伤[18]。2002年Ishimoto等认为中阶注射时，大量的外毛细胞已经被破坏[19]。2. 中阶注射增加了内淋巴液的液体压以及造成前庭膜的破裂从而造成耳蜗内的内外淋巴液混合,混合的淋巴液改变了内耳内环境的Na+和K+的动态平衡。3. 注射处同样造成了螺旋神经节和血管纹的破坏，直接进入的流动液体在盖膜的反作用下给Corti器造成了冲击损害，该压力同样能损害毛细胞。4. 内淋巴液在穿刺处的过量漏出将降低耳蜗内的跨膜电位，这将为细胞产生正常的机械运动造成阻碍[16]。
听力保护方面，2011年Kilpatrick运动纳米微量注射泵从中阶向小鼠耳蜗导入腺相关病毒，术后小鼠中低频听力(4kHz-22.6kHz)未发现明显改变，高频听力(32kHz，40kHz，45.2kHz)下降，他认为手术的听力保护机制有:①纳米微量导入系统的使用可控制注射液体的体积与速度到纳米级,最小液体体积可达到4.6nl，根据小鼠中阶内淋巴液体积只有0.19ul，本次注射的量为每次0-4.6nl，间隔一分钟。可使得耳蜗细胞逐渐适应内淋巴压力环境的改变而减少损伤。②外科操作方法采用标准非侵袭性步骤，中阶骨性外侧壁用牙科钻磨薄，保留膜性外侧壁的完整，整个操作过程内淋巴间隙保持完整，从而使得玻璃微量注射器的尖端刺入膜迷路外侧壁时不伴有内淋巴液漏出。此外也有不同的科学家提出了其他的听力保护机制，如:1.小体积注射，出生早期导入病毒。2013年Wang等将腺相关病毒和慢病毒导入小鼠耳蜗，试图探究一种病毒通过中阶导入合适时期的听力保护策略。本次实验采用了小体积(0.2ul)量的病毒注射，在大多数类型的内耳毛细胞发现表达发现各种病毒在血管纹的边缘细胞和中间细胞表达最高并且在小鼠出生后早期病毒导入时可保护听力[20]。2.分处注射和缓慢注射。2017年Gao等运用基因编辑技术通过耳蜗中阶导入Cas9-guide RNA复合物改善小鼠模型的人类遗传性耳聋，发现注射组相对于未注射组ABR听阈在5.66kHz有轻微升高，在8kHz及以上频率无明显改变，听力保存较好[21] 。分处注射和缓慢注射可能与听力保护有关，Kanzaki指出，5ul的病毒注入未发现对侧转染，而25ul的导入则会引起对侧转染，因此病毒在转入组织的分布可能与导入病毒的体积有关。
2.3 前庭阶入路
目前该入路的相关研究较少，可能是由于前庭阶解剖结构的复杂性导致。2009年徐金操通过前庭阶打孔的方式，向大鼠内耳导入Ad-Math1-EGFP，导入三天可在耳蜗组织铺片的耳蜗基底膜，球囊，椭圆囊和半规管壶腹嵴感觉上皮上良好表达。在冰冻切片的Corti氏器外毛细胞及支持细胞均有表达。同时耳蜗和前庭球囊斑也有良好的表达，且毛细胞纤毛形态正常，表皮板，网状表面及毛细胞之间的连接清晰可见。作者认为前庭阶导入与鼓阶导入相比，在解剖上更接近前庭器官，导入病毒后浓度高，在前庭器官的表达时间更早，效率更高。同时前庭膜与基底膜的通透性不一致，基底膜比前庭膜厚而致密，因此从鼓阶导入载体比从前庭阶导入更难到达中阶[22]。2010年徐金操运用前庭阶打孔的方法将Ad-Math1 -EGFP 成功导入大鼠耳蜗。观察可见导入Ad-Math1-EGFP7天后，耳蜗前庭毛细胞均未受到损害，与正常对照大鼠相比，组织形态正常，观察到内耳注入腺病毒一个月后，通过冰冻切片，在荧光显微镜下仍可见EGFP 的表达，同时术后游泳实验，CDM-CEP 阈值，Click 的ABR阈值与术前均无明显差异，可表示前庭功能及听觉功能未受明显损伤[23]。
3 前庭及内淋巴囊入路
3.1 前庭椭圆囊注射
许多的研究者研究此区域的药物损伤后毛细胞再生问题。2002年Praetorius测试了一种新的内耳基因导入的方法，他运用1型单纯疱疹病毒作为载体，运用在椭圆囊开一个小窗的办法，有效地将β-半乳糖苷酶的报告基因导入耳蜗，并在几乎所有的前庭及耳蜗的神经元上进行表达而没有造成听力损失。
3.2 内淋巴囊入路
在内耳液体微循环理论中包括两个学说，一个是Corti提出Guild补充和完善的纵向流动学说认为内淋巴囊具有吞噬和液体重吸收作用。第二个是辐射流动学说，Naftalin和Lawrence发现内淋巴在耳蜗和前庭各处局部的分泌上皮产生，同时也在这些相应的部位重吸收。内淋巴的生成及吸收均在膜迷路内完成。内淋巴囊是内淋巴的主要吸收部位，内淋巴囊中间部，细胞具有活跃的离子运转功能和吞噬作用。在内耳容量，压力电解质平衡调节中起着重要作用[24] 。有文献显示，内淋巴入路可以作为一种鼓阶入路的补充入路，1999 年的Yamasoba通过内淋巴囊入路将腺病毒载体Ad.RSVntlacZ 导入豚鼠内淋巴囊，内淋巴管，在前庭，壶腹，甚至耳蜗都有表达，主要是在内淋巴区域，血管纹的边缘细胞和Corti氏器的支持细胞等[25]。
4 半规管入路
2001年Kawamoto首先提出半规管手术入路，成功导入了巨细胞病毒启动子表达细菌基因lacZ的腺病毒载体(Ad.CMV–lacZ) 。不仅在前庭和耳蜗发现了病毒的导入，并且也实现了对耳蜗功能的保护。这种手术入路是来源于治疗人类良性位置性眩晕时的选择性迷路切除术[26] 。
其优点包括：1.在新生小鼠上已经实现载体在听觉细胞上的高表达。2012年Gassner在大鼠上进行后半规管的基因导入，发现在前庭和耳蜗的毛细胞都有表达，血管纹上的表达尤其显著(数据未显示)[27]。2017年Isgrig等在研究Useher综合征时，成功从新生小鼠后半规管向前庭系统及耳蜗导入腺相关病毒2/8 (AAV8-whirlin)，发现经半规管导入病毒在内毛细胞中的转导率(71.7-81.2%)较先前的圆窗导入法(15%)有提高[28]。2018年Isgrig等在新生耳聋伴前庭功能障碍小鼠(漩涡小鼠)内耳，研究后半规管入路的基因导入手段，成功将腺相关病毒导入新生小鼠前庭及耳蜗，前庭毛细胞(椭圆囊毛细胞)的转染率为53.1%，耳蜗内毛细胞的转染率为77.1%[29]。
2.实现了耳蜗功能的保护从而保护听力。其保护机制有两方面1.操作上较易，如2003年Nakagawa将新霉素溶液(NM)经后半规管途径(PSCC)导入小鼠内耳认为PSCC和水平半规管途径(LSCC)在颞骨外较易分离，此外，由于水平半规管和后半规管的管壁骨质较薄,因此较易将26号针头刺入[30]。2.半规管组导入基因可同时到达前庭系统和耳蜗系统，比耳蜗开窗法有较低的风险伤到血管和神经[26]。
分析半规管入路转染率较圆窗路径高的原因，Isgrig认为啮齿类动物在耳蜗底转的圆窗旁有大的耳蜗导水管，导入的病毒可能被耳蜗导水管里的脑脊液稀释或者从此处流失，而降低病毒浓度从而无法转染分布整个耳蜗。缺点：不能区分套管是否接触到内淋巴，骨质和套管的接触处难以用胶封闭，形成漏洞导致内外淋巴液漏(Kawamot)。这种基因导入手段也为探索其他突变基因的导入和临床应用提供参考。是一种有希望应用于治疗人类遗传性耳聋，前庭功能障碍疾病的手段。然而小鼠模型毕竟和人体有差异。
5 未来的发展和展望
目前通过手术方法进行内耳的基因导入的手段已经相对成熟，从圆窗入路到耳蜗开窗，以及前庭注射和半规管注射等，但是仍然存在一些问题，比如大多数文献只说明了转染率的多少而没有明确指出导入的成功率的问题,对于大动物实验而言，再高的表达率，成功率低则意味着对实验动物的浪费，解决此问题则需要更完善和标准的实验流程的制定。转染效率上：中阶的导入最为直接有效，但因为直接进入内淋巴，对导入液体体积和速度要求最高。前庭阶则是介于中阶和鼓阶之间的一种导入方式，并且在前庭的分布也相对于鼓阶和中阶有优势，是一种有潜力的入路手段。鼓阶的导入研究相对较多，如何达到耳蜗各转的均匀分布十分重要。多处开窗，及释放外淋巴减压等手段能否保护听力，需要进一步验证。此外，提高圆窗膜通透性，从而提高载体转染率的外界条件也需要深入研究。听力保护问题上：圆窗膜注射和半规管入路目前听觉功能保护优于耳蜗开窗入路。
当前，大动物模型的构造已成为实验研究的发展趋势。进一步探索猪的内耳结构，如：耳蜗导水管与圆窗的距离，内外淋巴液的流体压力，探索最适合听力保护的导入量和导入速度。并制定规范的实验操作标准，对提高转染成功率十分必要。
