分子生物学常用实验技术（page 3)

分子杂交技术

　　 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick 碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA 分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA 或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探针必须经标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。

第一节核酸探针标记的方法

　　核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA 和RNA 探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。

一、双链DNA 探针及其标记方法

　　分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA 探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA 探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。

1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA 分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA 聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA 链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500 个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP 的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。DNA 酶Ⅰ的用量和E.coli DNA 聚合酶的质量会影响产物片段的大小。DNA 模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
材料： 待标记的DNA。
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml
BSA。
(2)未标记的dNTP 原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3 种分别溶解于50mmol/L
Tris?Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP 或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA 聚合酶Ⅰ(4 单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L
Tris?Cl(pH7.5)中。
(5)DNA 酶Ⅰ:1mg/ml。
EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步骤:
(1) 按下列配比混合:
未标记的dNTP 10μl
10×切口平移缓冲液5μl
待标记的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP 或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA 聚合酶4 单位
DAN 酶I 1μl
加水至终体积50μl
(2) 置于15℃水浴60 分钟。
(3) 加入5μl EDTA 终止反应。
(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。
[注意] 1、3H，32P 及35S 标记的dNTP 都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA 酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA 酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。
2. 随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA 模板结合,在Klenow 酶的作用下,合成DNA 探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP 和酶的量。通常,产物平均长度为400-600 个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow 片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA 模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg 探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
材料：待标记的DNA 片段。
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。
(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
(3)Klenow 片段。
(4)20mmol/L DTT。
(5)未标记的dNTP 溶液：dGTP、dCTP 和dTTP 溶液，各5mmol/L。
[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(7)缓冲液A：50mmol/L Tris?Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5%
SDS。
操作步骤:
(1) 200ng 双链DNA(1μl)和7.5ng 随机引物(1μl)混合后置于eppendorf 管内,水浴煮沸5 分钟后，立即置于冰浴中1 分钟。
(2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf 管内混合下列化合物:
20mmol/L DTT 1μl
未标记的dNTP 溶液1μl
10×随机标记缓冲液1μl
[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
ddH2O 1μl
(3) 将步骤(1)eppendorf 管中的溶液移到步骤(2)管中。
(4) 加入5 单位(约1μl) Klenow 片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g 离心1-2 秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16 小时。
(5) 在反应液中加入10μl 缓冲液A 后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。
[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。
2、模板DNA 应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。

二、单链DNA 探针

　　用双链探针杂交检测另一个远缘DNA 时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA 探针的合成方法主要有下列两种1) 以M13 载体衍生序列为模板,用Klenow 片段合成单链探针; (2) 以RNA 为模板, 用反转录酶合成单链cDNA 探针。

1. 从M13 载体衍生序列合成单链DNA 探针合成单链DNA 探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP 的存在下,由Klenow 片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF 型M13 DNA 也可用于单链DNA 的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
材料：已制备好的单链DNA 模板（方法参见第十章中有关内容）。
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)10×Klenow 缓冲液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris?Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。
(2)0.1mol/L DTT 溶液。
(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4)40mmol/L 和20mmol/L 的未标记的dNTP 溶液。
(5)dCTP,dTTP,dGTP 各20mmol/L 的溶液。
Klenow 片段（5 单位/ml）。
(7)适宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。
0.5mol/L EDTA （pH8.0）。
操作步骤：
(1)在0.5ml eppendorf 管中混合如下溶液：
单链模板（约0.5pmol） 1mg
适当引物5pmol
10×Klenow 缓冲液3ml
加水至20ml
(2)将eppendorf 管加热到85℃ 5 分钟，在30 分钟内，使小离心管降到37℃；
(3)依次加入：
DTT 2ml
[a-32P]dATP 5ml
未标记的dATP 1ml
dGTP,dCTP,dTTP 混合液1ml
混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。
(4)加1ml（5 单位）Klenow 酶室温下30 分钟。
(5)加1ml20mmol/L 未标记的dATP 溶液20 分钟。68℃加热10 分钟，使Klenow 片段失活。调整NaCl 浓度，使之适宜于酶切。
(7)加入20 单位限制性内切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1 小时。酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP 或加0.5mol/LEDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L。
(9)用电泳方法分离放射性标记的探针。

2. 从RNA 合成单链cDNA 探针cDNA 单链探针主要用来分离cDNA 文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA 探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT 为引物合成cDNA 探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA 中通常含有多种不同的RNA 分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA 为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA 中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA 杂交双链经碱变性后,RNA 单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50 柱层析即可得到单链探针。
材料：已提纯的RNA 或mRNA
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。
(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。
(4)反转录酶(200000 单位/ml)。
(5)100mmol/L DTT。
250mmol/L MgCl2。
(7)1mol/L KCl。
0.5mol/L EDTA (pH8.0)。
(9)10% SDS。
(10)RNasin(40 单位/ml)。
操作步骤:
(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：
RNA 或mRNA 10.0ml
合适的产物(1mg/ml) 10.0ml
1mol/L Tris?Cl(pH7.6) 2.5ml
1mol/L KCl 3.5ml
250mmol/L MgCl2 2.0ml
5mmol/L dNTP 10.0ml
[a-32P]dCTP 10.0ml
0.1mol/L DTT 2.0ml
Rnasin 20U
加水至48ml
反转录酶(200000 单位/ml) 2ml
混匀后,稍稍离心，37℃保温2 小时。
(2) 反应完毕后加入下列试剂： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml
(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保温30 分钟以水解RNA。
(4) 冷却至室温后, 加入10ml 1mol/L Tris?Cl (pH7.4)。混匀。然后加入3ml 2mol/L HCl。
(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50 柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。[注意] RNA 极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC 处理后，灭菌备用。

三、末端标记DNA 探针
现以Klenow 片段标记3'末端为例说明末端标记的方法。
1、材料：待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。
2、设备：高速台式离心机，水浴锅等。
3、试剂：
(1)3 种不含标记的dNTP 各为200mmol/L。
(2)合适的限制酶。
(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。
(4)Klenow 片段(5U/ml)。
(5)10×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/mlBSA。
4、操作步骤：
(1)25μl 反应体系中用合适的限制酶酶切1μg 的DNA。
(2)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端标记缓冲液5ml 2mmol/L3 种dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量加水至50ml
(3)加入1 单位的Klenow 片段,室温下反应30 分钟。
(4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15 分钟。
(5)70℃加热5 分钟,终止反应。
用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50 柱层析分离标记的DNA。
[注意]
1、利用本方法可对DNA 分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA 片段。
2、对DNA 的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。
3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4 多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA 和平末端凹缺DNA 分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。

四、寡核苷酸探针
　　利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。
1、材料：待标记的寡核苷酸(10pmol/μl)。
2、设备：高速离式离心机，恒温水浴锅等。
3、试剂：
(1)10×T4 多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT,
1mmol/L Spermidine?HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。
(3)T4 多核苷酸激酶（10 单位/ml）。
4、操作步骤：
(1)100ng 寡核苷酸溶于30ml 水中。置65℃变性5 分钟，迅速置冰溶中。
(2)立即加入下列试剂：
10×激酶缓冲液5ml
[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml
T4 多核苷酸激酶2ml
加水至50ml
混匀后置37℃水浴20 分钟。
(3)再加入20 单位T4 多核苷酸激酶，置37℃水浴20 分钟后立即置冰浴中。
(4)Sephadex G-50 柱层析。

　　此方法是在每个探针的5'末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA 的杂交。因此，建议使用Klenow DNA 聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。

五、RNA 探针
　　许多载体如pBluescript, pGEM 等均带有来自噬菌体SP6 或E.coli 噬菌体T7 或T3 的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA 的RNA 聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA 探针。RNA 探针一般都是单链,它具有单链DNA 探针的优点,又具有许多DNA 单链探针所没有的优点，主要是： RNA NA 杂交体比DNA NA 杂交体有更高的稳定性,所以在杂交应中RNA 探针比相同比活性的DNA 探针所产生信号要强。RNA:RNA 杂交体用RNA 酶A 酶切比S1 酶切DNA:RNA 杂交体容易控制,所以用RNA 探针进行RNA 结构分析比用DNA 探针效果好。噬菌体依赖DNA 的RNA 聚合酶所需的rNTP 浓度比Klenow 片段所需的dNTP 浓度低,因而能在
较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。用来合成RNA 的模板能转录许多次,所以RNA 的产量比单链DNA 高。并且用来合成RNA 的模板能转录多次，可获得比单链DNA 更高产量的RNA。

　　反应完毕后，用无RNA 酶的DNA 酶Ⅰ处理,即可除去模板DNA,而单链DNA 探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA 分离。另外噬菌体依赖于DNA 的RNA 聚合酶不识别克隆DNA 序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA 合成的比率很低。因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA 的RNA 聚合酶及四种rNTP 一起保温时,所有RNA 的合成,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA 探针合成中,若模板中混杂其他DNA 片段,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase 特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA 会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。

第二节几种常见的杂交
　　分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA 或RNA 分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：
(1) Southern 杂交NA 片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA 或RNA。
(2) Northern 杂交:RNA 片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA 或RNA。根据杂交所用的方法,另外还有斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交等。有3 种固相支持体可用于杂交:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541 滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA 固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman 541 滤纸有很高的湿强度,最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA 的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。Whatman 541 滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点:它更便宜,杂交中更耐用,干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心,杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。

一、Southern 杂交
　　Southern 杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA 原位变性。
(2) 将DNA 片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。
(4) 让探针与同源DNA 片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA 所在的位置。
　　 Southern 杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA 在总DNA 中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA 量以及探针与目的DNA 间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern 杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg 与32 P 标记的高比活性探针的(>109cpm/μg)互补DNA。如果将10μg 基因组DNA 转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb 大小的单拷贝序列。将DNA 从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3 种1)毛细管转移。本方法由Southern 发明,故又称为Southern 转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA 变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA 片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30 分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern 转移强2-3 倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。

1、材料： 待检测的DNA，已标记好的探针。
2、设备： 电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。
3、试剂：
(1)10mg/ml 溴化乙锭（EB）。
(2)50×Denhardt's 溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA 加水至500ml,过滤除菌后于-20℃储存。
(3)1×BLOTTO:5g 脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，储于4℃。
(4)预杂交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml 鲑鱼精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)杂交溶液:预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。
0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
0.4mol/L NaOH。
(9)变性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH 加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris?Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纤维素滤膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸钠,用1mol/L HCl 调节pH 至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC 稀释。
4、操作步骤：
(1) 约50μl 体积中酶切10pg-10μg 的DNA, 然后在琼脂糖凝胶中电泳12-24 小时(包括DNA分子量标准物)。
(2) 500ml 水中加入25μl 10mg/ml 溴化乙锭,将凝胶放置其中染色30 分钟, 然后照相。
(3) 依次用下列溶液处理凝胶,并轻微摇动: 500ml 0.2mol/L HCl 10 分钟, 倾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸处理时间为20 分钟)，用水清洗数次,倾去溶液; 500ml 变性溶液两次,每次15 分钟,倾去溶液; 500ml 中和溶液30 分钟。如果使用尼龙膜杂交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盘中加20×SSC 液,将硝酸纤维素滤膜先用无菌水完全湿透,再用20×SSC 浸泡。将硝酸纤维素滤膜一次准确地盖在凝胶上,去除气泡。用浸过20×SSC 液的3 滤纸盖住滤膜,然后加上干的3 滤纸和干纸巾,根据DNA 复杂程度转移2-12 小时。当使用尼龙膜杂交时，该膜用水浸润一次即可，转移时用0.4mol/L NaOH 代替20×SSC。简单的印迹转移2-3 小时,对于基因组印迹,一般需要较长时间的转移。
(5) 去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×SSC 中洗5分钟,凉干后在80℃中烘烤2 小时。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。将滤膜放入含6-10ml 预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。在一定温度下(一般为37-42℃)预杂交3-12 小时，弃去预杂交液。
(7) 制备同位素标记探针（参见第一节），探针煮沸变性5 分钟。在杂交液中加入探针,混匀。如步骤（6）将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12 小时。
(9) 取出滤膜,依次用下列溶液处理,并轻轻摇动: 在室温下, 1×SSC/0.1% SDS, 15 分钟, 两次。在杂交温度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15 分钟, 两次。
(10) 空气干燥硝酸纤维素滤膜,然后在X 光片上曝光。通常曝光1-2 天后可见DNA 谱带。对于≥108 cpm/μg 从缺口平移所得探针,可很容易地从10μg 哺乳DNA 中检测到10pg 的单拷贝基因。

二、Northern 杂交
　　Northern 杂交与Southern 杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA 中的二级结构,保证RNA 完全按分子大小分离。变性电泳主要有3 种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern 转移相同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
1、材料：待检测的RNA 及制备好的探针。
2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3、试剂：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g 柠檬酸钠，溶于800ml 水中，用10mol/LNaOH 调pH 至7.4，定溶到1L。
(2)其他试剂：与Southern 杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC 处理。
4、操作步骤：
(1)RNA 经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA 转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。
(2)转移完毕后,以6×SSC 溶液于室温浸泡此膜5 分钟,以除去琼脂糖碎片。
(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2 小时。
(4) 用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2 小时。若于42℃进行,应采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's 试剂，0.1% SDS；若于68℃进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt's 试剂，0.1%SDS，（注意：BLOTTO 不能用于Northern 杂交）。
(5) 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分?μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24 小时。用1×SSC、0.1% SDS 于室温洗膜20 分钟,随后用0.2×SSC、0.1% SDS 于68℃洗膜3 次,每次20 分钟。
(7) 用X 光片(Kodak XAR-2 或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。
[注意]
(1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA 大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH 浸泡凝胶20 分钟,部分水解RNA 并提高转移效率。浸泡后用经DEPC 处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC 浸泡凝胶45 分钟。然后再转移到滤膜上。
(2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA,杂交前需用20mmol/L Tris?Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA 上的乙二醛分子。
(3)RNA 自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA 转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。
(4)含甲醛的凝胶在RNA 转移前需用经DEPC 处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH 溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA 分子(>2.3kb)转移的速度和效率。
　　 此外，碱可以除去mRNA 分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA 在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA 转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/LNaOH，转移结束后(4.5-6.0 小时)，尼龙膜需用2×SSC、0.1%SDS 淋洗片刻、于室温晾干。
(5)尼龙膜的不足之处是背景较高,用RNA 探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。如用中性缓冲液进行RNA 转移,转移结束后,将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间,80℃干烤0.5-2 小时,或者254nm 波长的紫外线照射尼龙膜带RNA 的一面。后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA 上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使RNA 上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。

三、菌落原位杂交
　　对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
1、材料：待检测的细菌平皿，已标记好的探针，硝酸纤维素滤膜等。
2、设备：恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。
3、试剂：
(1)LB 固体培养基。
(2)0.5mol/L NaOH。
(3)1mol/L Tris?Cl。
(4)1.5mol/L NaCl。
(5)0.5mol/L Tris?Cl。
预洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(7)预杂交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。其余试剂：与Southern 杂交相同。
4、操作步骤：
1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上：
(1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。
(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm 的宽度。
(4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3 个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。
(5) 用Parafilm 膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA 结合于硝酸纤维素滤膜。
2. 菌落的裂解及DNA 结合于硝酸纤维素滤膜
(1) 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH 的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3 分钟。
(2) 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH 重复步骤(1)。
(3) 吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris?Cl(pH7.4)的保鲜膜洼上。5 分钟后吸干滤膜, 再重复一次该步骤。
(4) 吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris?Cl (pH7.4)的保鲜膜小洼上5 分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30 分钟,使滤膜干燥。
(5) 将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80℃干烤2 小时,固定DNA。将固定在膜上的DNA 与32 P 标记的探针杂交。
５.杂交
(1) 盛有2×SSC 的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上,彻底浸湿5 分钟。
(2) 将滤膜转到200ml 预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30 分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。
(3) 用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交
信号的强度和清晰度。
(4) 将滤膜转到盛有150ml 预杂交液的玻璃中,在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68℃，而在
50%甲酰胺中杂交时用42℃)下,预杂交1-2 小时。
(5) 将32 P 标记的双链DNA 探针于100℃加热5 分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。杂交结束后,去除杂交液,立即于室温把滤膜放入大体积(300-500ml)的2×SSC 和0.1% SDS溶液中,轻轻振摇5 分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗一次，同时应避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC 和0.1% SDS 溶液洗膜两次,每次1-1.5 小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件,可用300-500ml 0.2×SSC 和0.1% SDS 的溶液于68℃将滤膜浸泡60 分钟。把滤膜放在纸巾上于室温晾干后,把滤膜(编号面朝上)放在一张保鲜膜上,并在保鲜膜上作几个不对称的标记,以使滤膜与放射性自显影片位置对应。
(9) 用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X 光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16 小时。
(10) 底片显影后,在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置,同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸,通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。

四、斑点杂交
　　斑点杂交是指将DNA 或RNA 样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA 或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA 或RNA 的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。
1、材料：待分析的DNA 或RNA 样品，已标记的探针。
2、设备：狭槽点样器，真空泵，恒温水浴，真空烤箱等。
3、试剂：
（1）100% 甲酰胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纤维素滤膜。
（6）滤纸。
4、操作步骤：
(1) 10μl 样品与20μl 100%甲酰胺、7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC 混合。混合置于68℃，15分钟后置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH 清洗点样器,再用无菌水充分冲洗。将一张经20×SSC 浸润的滤纸铺在点样器上,上面再铺上一张经20×SSC 浸润1 小时的硝酸纤维素滤膜，加盖并夹紧，接通真空泵。
(3) 用10×SSC 清洗各样孔。在每一样品中加两倍体积的2×SSC,混合后加样于孔中。外围几个孔中加2μl 染料定位,缓慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC 清洗两次。继续抽吸5 分钟,吸干滤膜。
(4) 取出滤膜,夹在两张滤纸中间, 80℃真空烘干2 小时。按上述Southern 或Norhtern 杂交所述的方法与放射性标记探针杂交。
[注意]
1、在放射自显影时应注意滤膜必须干燥，并覆盖上保鲜膜，否则，滤膜将与X-光片粘在一起，使以后的操作困难。
2、在杂交过程中，整个滤膜应一直是湿润的，不得干涸。第三节杂交反应的条件及参数的优化
不同的反应条件对杂交结果的影响如下：
(1) 根据杂交液的体积确定杂交的时间：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA 在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。
(2) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时,则在68℃杂交,而在50%甲酰胺溶液中时,则在42℃下杂交。
(3) 选用不同的封闭试剂：如Denhardt's 试剂、肝素或一种由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO, 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA 或酵母DNA，并和SDS 一起使用。与Denhardt's 试剂相比,BLOTTO 价格便宜,使用方便,同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA 杂交。一般而言,尼龙膜用Denhardt's 试剂比用BLOTTO 能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言,通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。
(4)根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度,许多杂交膜一起反应时,连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。
(5) 在杂交过程中加入其他化合物, 如反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 杂交速度可增加约10 倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的粘稠性而使操作困难。因此，除非在滤膜上含有的目的DNA 量很少,或放射性探针的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度,如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式（高浓度SSC）, 反之则选用非严紧型洗脱方式（低浓度SSC）。洗脱通常在低于杂交体解链温度12-20℃的条件下进行。解链温度(melting temperature, Tm )是指在双链DNA 或RNA 分子变性形成分开的单链时光吸收度增加的中点处温度。通常富含G?C 碱基对的序列比富含A?T 碱基对序列的Tm 温度高。有关Tm 的计算方法，请参考第八章。
(7) 根据标记探针的浓度及其比活性,选择不同的杂交条件及检测方法。一般使用新的同位素可获得较强的信号。在水溶液中杂交时,用6×SSC 或6×SSPE 溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时,应该用具有更强缓冲能力的6×SSPE。上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。

思考题：
1、核酸探针的标记方法有哪些？
2、要获得好的杂交结果，需注意哪些因素？
3、如果放射自显影后，如X-光片背景很黑，请分析原因及写出预防措施。

第十章测序技术

　　在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger 等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam 和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G 四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE 胶上电泳进行检测，从而获得DNA 序列。目前Sanger 测序法得到了广泛的应用。Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T 或C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs 和ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

第一节非同位素银染测序系统操作技术

一、概述：

　　Promega 公司的SILVER SEQUENCETM DNA 测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90 分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。此外, SILVER SEQUENCETM 系统用未修饰的5'OH 寡聚核苷酸作为引物， 减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。Taq DNA 聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA 聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰品，对于双链DNA 模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。SILVER SEQUENCETM 系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP 可清除由GC 丰富区域所引起的条带压缩现象。退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR 产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC 含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer 的GC 含量约为50%的引物可得到最佳结果。由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA 产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2pmol 模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA 模板(如PCR 反应产物)快速重退火所引起的问题。(3).高温聚合酶反应减弱了DNA 模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。

二、材料待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。

三、设备高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR 仪。

四、试剂

（1）SILVER SEQUENCETM DNA 测序试剂盒。
（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺W/V，2%甲叉双丙烯酰胺W/V)：95g丙烯酰胺，5g 甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm 过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2 周。
（3）10%过硫酸铵，0.5g 过硫酸铵溶于4ml 水中，定容至5ml，应新配新用。
（4）10×TBE 缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ?2H2O，溶于双蒸水中定容至1 升，置于4℃下可贮存2 周，其pH 约为8.3。
（5）TBE 电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE 备用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2 升备用。
（8）染色溶液：硝酸银2 克，甲醛3ml，溶于2 升超纯水中备用。
（9）显影溶液：60 克碳酸钠（Na2CO3)溶于2 升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。

五、操作步骤：
　　成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA 模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点：
（1） DNA 的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA 一起电泳。
（2） 分光光度法对于很多DNA 提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA 浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm 光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA 浓度。
（3） DNA 制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA 样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm 光吸收。
（一）测序反应：
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf 管(G、A、T、C)。每管加入2ml 适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1 滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf 管中混合以下试剂：
（1） 样品反应：
质粒模板DNA 2.1pmol
5×测序缓冲液5ml
引物4.5pmol
无菌ddH2O 至终体积16ml
（2）对照反应
pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml
5×测序缓冲液5ml
pUC/M13 正向引物(4.5pmol) 3.6ml
无菌ddH2 O 至终体积16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2 步)中加入1.0ml 测序级Taq DNA 聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3 步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml 加入每一个d/ddNTP 混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf 管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350 碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA 测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
[注意] 1、测序所用模板DNA 的量一般按下面要求加入：模板种类/长度模板量
200bp (PCR 产物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA 弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
2、计算与4.5pmol 相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n 为引物碱基数
计算与1pmol 相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n 为模板碱基对数
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n 为模板碱基数
3、为阻止Taq DNA 聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1 开始。
模式1：适用于引物<24 碱基或GC 含量<50%
95℃ 2 分钟。然后： 95℃ 30 秒(变性), 42℃ 30 秒(退火), 70℃ 1 分钟(延伸)。
模式2:适用于≥24 碱基或略短的GC 含量≥50%的引物。
95℃ 2 分钟, 然后: 95℃ 30 秒(变性), 70℃ 30 秒(退火/延伸)。4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。

（二）、测序凝胶板的制备
1、玻璃板的处理：
　　　银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
（1）短玻璃板的处理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml 粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。
B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。
C. 4-5 分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程,每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。
2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。
(2)、长玻璃板的处理
A. 用浸透Sigmacote 溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
B. 5-10 分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote 溶液。
[注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH 浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。
2、凝胶的制备：
（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote 处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm 或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis 和10×TBE 缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm 的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED 和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6 分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED 和过硫酸铵。
凝胶终浓度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE 缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。

（三）电泳：
1、预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE 缓冲液。
（3）稀释10×TBE 缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）有些电泳槽，如LKB 的Macrophor 等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。
（5）按30V/cm 的电压预电泳20-30 分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC 丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。

[注意]
（1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm 左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
（2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2、样品的制备：
　　当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3 分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4-6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm 的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3、上样及电泳
　　关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm 进行电泳，5 分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm 长，0.2mm 厚的凝胶板，在2500V 恒压状态下电泳2 小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA 降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。

[注意]
1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。

（四）、测序凝胶的银染
　　染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20 分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3 次，每次2 分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20 秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30 分钟。
5. 凝胶显影：
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10 秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10 秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 立刻将凝胶转移至1 升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1 升显影液中继续显影2--3 分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2 分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF 胶片保留实验结果。

[注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。
1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。
2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher 和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500 或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。
3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
4. 如果凝胶厚度超过0.4mm 或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm 薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5 秒。
5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

（五）、EDF 胶片显影
　　使用EDF 胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF 胶片之后可增强条带可读性。
1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间, 用一小条EDF 胶片曝光不同时间, 检查不同的曝光强度, 一般曝光20--40 秒可得较好结果。
2. 在红灯下找到EDF 胶片有缺刻的一角, 然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。
3. 在EDF 胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20 秒。
4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF 胶片，可使用下列操作过程:
a. 在Kodak GBX 显影液中显影1-5 分钟;
b. 水洗1 分钟;
c. 在Kodak GBX 定影液中定影3 分钟;
d. 水洗1 分钟.
[注意] 1. 进行EDF 胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作, 以免印上指纹。同时注意EDF 胶片不能用自动胶片处理器。
2. 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF 胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。
3. 曝光时间短则EDF 胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。

第二节T7 DN A 聚合酶测序技术

一、概述

　　T7 DNA 聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA 聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA 聚合酶又称T7 测序酶。使用T7 测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此, 放射自显影所得到的结果较为清晰易辩, 对于许多模板来说, 使用含有dGTP 的混合物即可得到理想的测序结果。然而, 如果出现了带压缩的问题，则用含dITP 的混合物来取代常规的dGTP。dITP 的掺入，使在富含GC 的模板中也能有效地消除带压缩现象。
T7 测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow 片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且不需要进行追加反应(Chase step)。然而对于有紧密二级结构的区域, 错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况，应使用一些高温DNA 聚合酶，如Promega 公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA 聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。T7 DNA 聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow 酶和AMV 反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5'-3'的DNA 合成活性和极低的3'-5'端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反转录酶AMV 而言，则可使条带非常的均一，并且它的放射性背景极低。T7 DNA 聚合酶测序时DNA 的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第二步方为双脱氧链末端终止的DNA 合成过程。在第一步过程，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的DNA 片段。

二、材料待测的DNA 模板，可用双链或单链模板。

三、设备高压电泳仪，测序用电泳槽，照相显影用大号塑料盆，制胶设备，吹风机，放射自显影盒，X-光片。

四、试剂
1、5×T7 DNA 聚合酶缓冲液：200mmol/L Tris?Cl, pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 250mmol/L NaCl。
2、引物：使用通用引物pUC/M13 正向或逆向引物。
3、DTT ： 0.1mol/L。
4、5×常规标记混合物：7.5mmol/L dGTP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。
5、5×dITP 标记混合物：15mmol/L dITP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。
6、dNTP A 溶液（适用于dGTP): 80mmol/L dGTP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/LdTTP, 50mmol/L NaCL。
7、ddG 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddGTP。
8、ddA 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddATP。
9、ddT 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddTTP。
10、ddC 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddCTP。
11、dNTP B 溶液（适用于dITP): 160mmol/L dITP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/LdTTP, 50mmol/L NaCl。
12、ddG 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddGTP。
13、ddA 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddATP。
14、ddT 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddTTP。
15、dd C 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddCTP。
16、测序用T7 DNA 测序酶。
17、酶稀释缓冲液：10mmol/L Tris?HCl, pH7.5, 5mmol/L DTT, 0.5mg/ml BSA 。
18、终止溶液： 95%甲酰胺，20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰。
19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP, 35S 的优点是可使条带为窄而清晰，并且操作更为安全。放射强度为：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。
20、TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, pH7.5。
21、上节所述的凝胶制备过程中的全套试剂。
22、X 光显影液：H2O：50℃ 800ml，米吐尔2.2g，无水Na2SO3 72g，对苯二酚8.8g，无水NaCO3 48g , KBr 4g， 定容至1000ml 备用。
23、F-5 坚膜定影液：水600ml , Na2S2O3 240g, Na2SO3 15g, 冰醋酸13.4ml；硼酸7.5g ，粉状钾矾15g ，定容至1000ml 备用。
24、TYP 肉汁培养基：16g 蛋白胨，16g 酵母提取物，5g NaCl, 2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。
25、20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）储备液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac储备液等体积混合。

五、操作步骤：
（一）、模板制备
1、M13 单链模板制备：在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG 的培养基上铺板之后, 含有M13 重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑"，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的细菌慢的缘故, 从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。
（1）过夜培养的宿主细胞(如NM522 或JM101)用3ml TYP 肉汁培养基以1:100 稀释。在37℃强烈震荡1 小时之后, 细胞进入对数早期。此时, 将一个合适的含有重组M13 的噬菌斑(连同琼脂)用滴管转入该细胞培养液中。
（2）37℃强烈震荡(300rpm) 培养6 小时。
（3）把细胞培养液转入两只1.5ml eppendorf 管, 12000g 离心15 分钟。上清液转移到新的eppendorf 管再离心15 分钟。小心地取出1-1.2ml 上清液(注意不能触及沉淀), 再转到新的eppendorf管。.
（4）将0.25 体积的含20％PEG(-8000)的3.75M 醋酸铵(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌体。混匀后置冰上30 分钟, 再以12000g 离心15 分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一次, 用吸液器尖头将残留的PEG 充分吸干净。此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。
（5）将沉淀物重溶于400ml TE 缓冲液中。
（6）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈震荡1 分钟，12000g 离心5 分钟。
（7）将水相转入一新的eppendorf 管, 注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡1 分钟, 12000g 离心5 分钟。
（8）将上层水相转入另一新的eppendorf 管, 重复第7 步的提取, 如有必要重复多次直至二相之间无可见物质存在。
（9）将上层水相转入一新的eppendorf 管, 加等体积氯仿, 强烈振荡1 分钟后, 12000g 离心5分钟, 多次重复此步骤。
（10）将上层水相转入新的eppendorf 管, 加0.5 倍体积的7.5 mol/L 醋酸铵, 2 倍体积乙醇, 混匀后-20℃放置30 分钟。
（11）12000g 离心15 分钟, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗