功能饮料中成分的同时检测
LC-UV法维生素B6、烟酸和咖啡因同时检测
本方法采用常规液相色谱配合可变波长紫外检测器，可以实现在不加离子对试剂的前提下实现维生素B6、烟酸和咖啡因的同时分离。样品仅需简单过滤后，即可直接检测。分析时间短，26min 即可完成三种化合物的检测。
维生素B6、烟酸等B 族维生素是人体不可缺少的重要营养素，对于多种疾病的预防治疗有重要辅助作用。目前维生素B6、烟酸和咖啡因已被作为功效成分添加于功能饮料中。目前国家标准规定的方法(GB/T 5009.197-2003)使用高效液相色谱法测定维生素B6、烟酸和咖啡因需以硫酸月桂酸钠、1- 癸烷磺酸钠等离子对试剂为流动相。本方法采用常规液相色谱配合可变波长紫外检测器，可以实现在不加离子对试剂的前提下实现维生素B6、烟
酸和咖啡因的同时分离。饮料样品只需简单过滤，即可进样。
实验条件
仪器配置
Thermo Ultimate 3000 系统：泵：DGP-3600;自动进样器：WPS-3000SL;柱温箱：TCC-3000;
检测器：DAD-3000;色谱软件：Chromeleon 7.1;
测定条件
分析柱：Acclaim PA II, C18, 4.6×150mm, 5μm;PN: 063197, SN：001323;流动相：A：0.025%TFA 的水;B：乙腈;梯度见表1;进样量：10μL;柱温：30℃;检测波长：见表2。
表1. 梯度淋洗条件
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时间(min) |
流速(ml/min) |
A (%) |
B (%) |
|
0 |
1 |
0 |
100 |
|
5 |
1 |
0 |
100 |
|
8 |
1 |
12 |
88 |
|
14 |
1 |
22.2 |
77.8 |
|
15 |
1 |
100 |
0 |
|
19 |
1 |
100 |
0 |
|
19.05 |
1 |
0 |
100 |
|
26 |
1 |
0 |
100 |
表2. 波长变化条件
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时间(min) |
波长(nm) |
|
0 |
262 |
|
4.5 |
291 |
|
10 |
275 |
|
15 |
262 |
|
26 |
262 |
样品处理
将特饮样品经过两层0.45μm 的滤膜过滤后装瓶，待测。
实验分析
标准品色谱图见图1、2、3。
图1. 五针VB6 叠加谱图(500μg/L，291nm)。
图2. 五针烟酸叠加谱图(2mg/L，262nm)。
图3. 五针咖啡因叠加谱图(5mg/L，275nm)。
线性、检出限
以标样色谱峰面积对浓度做工作曲线，具有良好线性，线性相关系数r 大于0.999。线性数据见表3 所示。分别对500μg/L 的VB6、2mg/L 的烟酸和5mg/L 的咖啡因标准溶液做重现性考察，RSD 分别为<2.1%，具体见表3。
表3. VB6、烟酸和咖啡因线性范围及重现性
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分析物 |
波长(nm) |
线性范围(mg/L) |
标准曲线 |
r2 |
浓度（mg/L） |
RSD (%, n=5) |
|
VB6 |
291 |
0.1~10 |
Y=0.477X |
0.9999 |
0.5 |
2.09 |
|
烟酸 |
262 |
1~100 |
Y=0.408X |
1.0000 |
2 |
1.42 |
|
咖啡因 |
275 |
5~200 |
Y=0.478X |
0.9999 |
5 |
1.80 |
实际样品分析
按照样品前处理方法测定三种批次的相同品牌功能饮料样品，测定结果如图4。
图4. 样品谱图
表4. 样品中各组分含量结果
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VB6（ppm） |
烟酸（ppm） |
咖啡因（ppm） |
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第一瓶第一次进样 |
3.1959 |
35.8177 |
200.0183 |
|
第一瓶第二次进样 |
3.1587 |
35.3990 |
197.6941 |
|
第一瓶第三次进样 |
3.1935 |
35.7504 |
199.6872 |
|
第一瓶第四次进样 |
3.1824 |
35.6723 |
198.0955 |
|
第一瓶第五次进样 |
3.2426 |
36.3285 |
202.2690 |
|
第二瓶 |
3.1265 |
35.0045 |
194.5447 |
|
第三瓶 |
3.1221 |
34.9055 |
194.1764 |
|
平均值 |
3.174528571 |
35.55399 |
198.0693 |
|
STD |
1.338% |
1.3915% |
1.4831% |
结果讨论
本方法根据功能饮料样品的标识含量，选取相关浓度的标准品对VB6、烟酸和咖啡因做标准曲线，线性范围在40倍以上，线性良好，根据标准曲线得出的数据接近饮料中标明的浓度(咖啡因200ppm，烟酸40ppm，VB64ppm)，通过放大谱图可以看到，目标化合物附近几乎没有任何干扰，结果证明该方法适合饮料类样品中相关化合物的检测。如果采用DAD
检测器进行不同时间进行不同波长的设定，可以更有效的降低干扰。本实验通过对相同低浓度的标准品反复进样得到该方法的精密度数据，RSD<2.1%，又分别对同一瓶饮料里的不同样品和不同瓶饮料里的样品进行重复性实验，RSD<1.5%，大量数据显示Thermofisher
U3000 系列液相色谱仪适合对该类型饮料进行检测。该方法样品仅需简单过滤后，即可直接检测。分析时间短，26min 即可完成三种化合物的检测。
小结
本方法采用常规液相色谱配合可变波长紫外检测器，可以实现在不加离子对试剂的前提下实现维生素B6、烟酸和咖啡因的同时分离。饮料样品只需简单过滤，即可进样。该方法样品仅需简单过滤后，即可直接检测。分析时间短，26min 即可完成三种化合物的检测。对同一瓶饮料里的不同样品和不同瓶饮料里的样品进行重复性实验，RSD<1.5%。本文大量数据显示Thermofisher U3000 系列液相色谱仪适合对该类型饮料进行检测。
