exFoxp3 Th17细胞对自身免疫关节炎的作用机制研究（一）

“我是谁?我从哪里来?我要到哪里去？” 是柏拉图提出的经典哲学三大问，小编每天早上起床前都要用这个问题叫醒我沉睡的灵魂。在本期带来的经典文献回顾中，请跟随本文作者一起听一听ex Foxp3 TH17细胞的深刻哲学独白吧！

一、故事背景

自身免疫性疾病通常由调节性T细胞（Treg细胞）和产生干扰素17的辅助T细胞（ TH17细胞）失衡所导致，严重影响着人类的健康。但TH17细胞的来源仍然有很多未知，于是，主人公ex Foxp3 TH17细胞的独白在自身免疫性关节炎中开始了。

二、哲学独白

第一问 我从哪里来

exFoxp3 TH17细胞闷闷不乐托腮思考：我作为TH17细胞的一员，感觉跟其他TH17细胞小伙伴儿们不是特别合群，常常有不一样的感觉，我是从哪里来的呢？

让我从头开始捋一捋，先找找影响自身免疫性关节炎的关键人物：表达Foxp3的Treg细胞已经知道是抑制免疫应答的关键角色，小鼠缺失Foxp3会产生自身免疫疾病，持续表达则会抑制自身免疫，可见Foxp3表达的稳定性是两者平衡的重要因素。

那么Foxp3的稳定性对自身免疫关节炎有什么影响呢？ Treg细胞的发展和功能受IL-2调控，Foxp3+T细胞由Foxp3+-稳定CD25（IL-2Rα）hi和Foxp3+-不稳定CD25lo细胞群组成。作者将CD25hiFoxp3+CD4+细胞和CD25loFoxp3+CD4+细胞（来源于未处理的DBA/1 Foxp3hCD2小鼠，hCD2作为标签指示Foxp3表达情况）转移到胶原诱导型关节炎（collagen-induced  arthritis  ，CIA）疾病模型小鼠上，测定临床评分及踝关节损伤情况，发现CD25hiFoxp3+CD4+细胞与对照组及CD25loFoxp3+CD4+细胞相比减轻了关节肿胀和损伤等症状（图1a，b）。将细胞经CFSE染料标记后再转移，结果显示在脾脏和引流淋巴结（dLNs）中CD25loFoxp3+CD4+细胞丢失了部分Foxp3的表达（30-50%）（图1c）。由此可见， CD25loFoxp3+CD4+细胞因为丢失了Foxp3而没有办法缓解发炎和骨损伤症状。思考到这里，我忍不住想问了：丢掉Foxp3的CD25loFoxp3+CD4+细胞去哪了？

别着急，我们继续追踪细胞更长时间的发展， 将total Foxp3 + 、CD25hiFoxp3+CD4+和CD25loFoxp3+CD4+细胞（来源于B6.Ly5.1 Foxp3hCD2小鼠，donor）转到C57BL/6 Ly5.2 关节炎小鼠（host）模型中，检测Foxp3和IL17表达， CD25loFoxp3+CD4+细胞失去部分Foxp3表达，产生了更高的IL-17 （图1d，e）。且检测到CD25loFoxp3+ 来源的Ly5.1+Foxp3-CD4+ T细胞比naïve  CD4+ T细胞来源的有更多IL-17和CCR6的表达（两者为TH17细胞marker）。这下清楚了，原来这些CD25loFoxp3+CD4+细胞丢失了Foxp3以后就变成我（exFoxp3 TH17细胞)了，我是从CD25loFoxp3+CD4+细胞分化而来呀。

Figure 1. CD25loFoxp3+ T cells are unstable Foxp3⁺ T cells that convert to T_H17 cells under arthritic conditions. 

第二问 我是谁

原来我是从CD25loFoxp3+CD4+细胞而来，那我到底是谁？我的祖先是谁？

CD25loFoxp3+CD4+细胞丢失Foxp3成为exFoxp3 T细胞，那我的祖先是不是exFoxp3 T细胞呢？那就跟着exFoxp3 T细胞看一看究竟吧。

百奥赛图科普系列知识中有提到荧光报告基因小鼠有示踪作用，本节实验作者采用荧光标记的Foxp3-GFP-Cre小鼠与Rosa-loxp-Stop-loxp-YFP小鼠交配，GFP^-表示Foxp3^-细胞，GFP⁺表示细胞正在表达Foxp3，GFP表达之后， 同时cre酶表达与loxp位点结合将stop去除，YFP荧光表达，但如果紧接着Foxp3表达后丢失，则这部分细胞的GFP变为阴性，YFP仍表达，因此，YFP⁺则表示正在表达或者曾经表达过Foxp3^[2-3]。根据荧光表达情况可以发现，关节炎小鼠模型中GFP^-YFP⁺细胞（exFoxp3 T细胞）占CD4⁺T细胞的比例，关节处比淋巴器官高，且有选择性的集聚在关节滑膜处（图2a）。与GFP^-YFP^-细胞（Foxp3-CD4+ T细胞）相比，exFoxp3细胞产生更多的RANKL（转录因子κB受体活化因子配体）和CCR6分子（图2b） 。IL17阳性的exFoxp3 T细胞在炎症关节中比例最高（图2c） 。这均表明exFoxp3 T细胞获得了激活TH17表型（ex Foxp3 TH17细胞，这就是我啦）并聚集在发炎的滑膜中。

嗯，找到了我的祖先ex Foxp3 T细胞，那让我来研究一下我属于哪个部落？

exFoxp3 T细胞可能的来源有三个：tTreg细胞（胸腺来源Treg细胞）、pTreg细胞（周边来源的T_reg细胞）、激活的传统T细胞（表达片刻Foxp3）。Treg细胞特征性表达Foxp3并具有特异脱甲基区域，且表达一些其他标志物分子。将GFP^-YFP^-、 exFoxp3 T细胞、GFP⁺YFP⁺细胞的部分分子进行流式表达和甲基化的分析。流式数据结果显示exFoxp3 T细胞与GFP⁺YFP⁺细胞相比，GTIR、Nrp1、KLRG1表达相近，CD25、FR4、OX40、CD39、CD103表达较低。说明exFoxp3 T细胞表达了更多的Treg 细胞marker，还是与传统T细胞有一定区别（图2d）。那属于哪一类Treg细胞呢？ tTreg细胞已知其Foxp3位点是脱甲基的。作者进一步通过Foxp3、IL2rα、Ctla4序列CpG甲基化程度进行分析， exFoxp3 T细胞中Foxp3序列大部分被甲基化，Il2ra部分被甲基化（图2e）。这一结果与已知的tTreg细胞特征有所不同。另外，基因表达分析发现exFoxp3 TH17细胞高表达优先在pTreg细胞表达的分子Cxcr5、Ccr8、Rora、Rorc（更多数据请查阅原文补充材料）；文中结合更多实验表明ex Foxp3 TH17细胞很可能来源于pTreg细胞亚群。

Figure 2. Localization, marker gene expression and DNA methylation status of exFoxp3 T cells in arthritic mice. Results are shown from fate mapping analyses of arthritic Foxp3-GFP-Cre × ROSA26-YFP mice that were performed 2 weeks after secondary immunization.