Molecular Devices使用多能诱导干细胞(iPSC)来源的肝细胞球进行高内涵3D毒性分析

特点：

• 使用人类多能诱导干细胞来源的肝细胞形成肝细胞球

• 对体外筛选的3D模型进行肝毒性评价

• 3D图像分析过程中对目标样品进行识别和分割，以达到最佳分割效果

背景介绍：

在发育生物学和组织生物学中，3D细胞球建模方式能够加快转化研究进程，因此越来越受到人们的重视。如何对3D样本进行更高通量的定量分析成为了热门研究课题。

在本实例中，MD公司建立并优化了一种分析方法，能够对人类多能诱导干细胞来源的3D肝细胞球进行共聚焦成像和毒性评估（图1）。

使用免洗染色法进行肝毒性评价：

1. 用肝毒性测试化合物处理细胞球72小时

2. 用溶解于无菌PBS中的三种荧光染料对细胞球进行染色。三种染料的浓度分别为：

• 2 μM calcein AM

• 3 μM EthD-1

• 10μM Hoechst 33342 (Life Technologies)

此外，为了评价化合物对凋亡信号的激活和对线粒体形态的影响，所用的染料浓度分别为：

• 7.5 μM CellEvent Caspase 3/7

• 200 nM MitoTracker Orange (Life Technologies)

肝细胞球的形成：

本实例使用的细胞为：

• 人类多能诱导干细胞来源的肝细胞 iCell Hepatocytes 2.0 (Cellular Dynamics International)

• HepG2细胞 (ATCC)

操作流程

1. 按照标准操作流程将冻存细胞复苏；

2. iCell Hepatocytes 2.0 铺板进行2D培养；

3. 贴壁细胞用Accutase酶消化后与Geltrex 基质(ThermoFisher Scientific)混合，细胞混合液以1000 cells/well的密度种植在低吸附成球孔板中(InSphero or Corning)；

4. 将孔板以300 g转速离心2分钟使细胞沉淀并去掉基质中的气泡，然后将孔板放入细胞培养箱，在37°C, 5% CO2条件下进行培养。培养HepG2 细胞无需加入基质；

5. 培养24–48小时后细胞球形成。

将染料加入细胞球培养体系中孵育2小时，然后采集图像。染料无需洗脱，加样过程小心谨慎，避免损伤细胞球进而造成细胞球解体或偏离原位。典型的细胞球染色结果如图 2所示。

高通量3D图像的采集和分析过程：

采用ImageXpress® Micro 共聚焦高内涵成像系统(Molecular Devices)采集图片，具体设置如下：

• 物镜种类--10倍镜和20倍镜

• 层扫间距--5-10μm

• 层扫范围--100-120μm

• 层扫起始位置--多孔板孔底

所有的结果中都包含有2D maximum投射图像，分析过程中可以对这些图像进行保存和调用。

识别并分析3D样品

使用MetaXpress® 高内涵图像采集分析软件对3D图像进行分析。CME用户模块编辑器中新增了3D分析模块(图3) ，该模块能够对3D结构的体积、荧光强度、距离等参数进行量化并对图像进行批量分析。其中 “Find Spherical Objects”功能可以对目标结构的形态学参数（最小和最大宽度，最小和最大Z轴层数）和目标结构与背景之间荧光强度的差值进行自定义设置，对不同大小的目标结构（小到细胞器，大到多细胞团）进行定义。比如将形态参数设定为：

• 细胞核宽度范围--5-15 μm

• 细胞核层数--1-2层

• 细胞核与背景的荧光强度差--200 荧光单位

• 肝细胞球宽度范围--100-300 μm

• 肝细胞球层数--5-7层

• 肝细胞球与背景的荧光强度差-- 400 荧光单位

分析结果包括每个目标结构的球体体积、直径（或平均体积、平均直径），以及特定荧光通道中球体的总荧光强度和平均荧光强度等参数。