（三）操作方法

1．安装夹心式垂直板电泳槽

夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由一个上框形凝胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。电泳槽由上储槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下储槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠储液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装：

（1）将上储槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。

（2）将上、短玻璃板分别插到上框形硅橡胶的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

（3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上储槽上，短玻璃板应面对上储槽。

（4）将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽 ，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽 。

（5）竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。

2．配胶

① 分离胶 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝胶缓冲液（pH8.9）2.5ml，分离胶贮液5.0ml，重蒸馏水2.5ml，充分混匀，抽气10min，最后加AP 10 ml。

② 浓缩胶 pH6.7 25% PAA：浓缩胶缓冲液∶浓缩胶贮液∶40%蔗糖溶液∶核黄素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3．制备凝胶板

不连续体系采用不同孔径及pH的分离胶与浓缩胶 ，凝胶制备应分2步进行。

① 分离胶的制备：根据实验要求，选择最终丙烯酰胺的浓度，本实验需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加胶方式不同于连续系统。混合后的凝胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1cm注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水（约3-4mm）用于隔绝空气，使胶面平整。为防止渗漏，在上、下储槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。用滤纸条吸去多余的水，但不要碰破胶面。如需预电泳，则上、下储槽的蒸馏水倒去，换上分离胶缓冲液，10mA电流电泳1h，终止电泳后，弃去分离胶缓冲液，用注射器取浓缩胶缓冲液洗涤胶面数次，即可制备浓缩胶。

② 浓缩胶制备：浓缩胶为pH6.7 25% PAA，混合均匀后用细长的滴管将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内（即分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。在上、下储槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。在距离电极槽10cm处，用日光灯或太阳照射，进行光聚合，但不要造成大的生温。在正常情况下，照射6-7min，则凝胶由蛋黄透明变成乳白色，表明聚合作用开始。继续光照30min，使凝胶聚合完全。光聚和完成后放置30-60min，轻轻取出样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体，加入稀释10倍pH8.3的Tris-甘氨酸电极缓冲液。使液面没过玻璃板约0.5cm，即可加样。

4．加样

作为分析用的PAGE加样量仅需几微克，2-3ul血清电泳后就能分出几十条蛋白区带。为防止样品扩散，应在样品中加入等体积40%蔗糖（内含少许溴酚兰）。用微量注射器取5ul上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。

5．电泳

将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接（方向切勿接错）。接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10 mA 。待样品进入分离胶时将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘1cm时，将电流调回到零，关电源及冷却水。分别收集上、下贮槽电极缓冲液置试剂瓶中，4℃贮存还可用1-2次。旋松固定螺丝，取出硅橡胶框，用不锈钢铲轻轻将一块玻璃板撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。

6．固定，染色

本实验采用0.05%考马斯亮蓝R250（内含20%磺基水杨酸）染色液，染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min左右。

7．脱色

用7%乙酸侵泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或褪色摇床，则可缩短褪色时间。脱色液经活性碳脱色后，可反复使用。

（四）注意事项

1．制备凝胶应选用高纯度得试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。Acr及Bis是制备凝胶得关键试剂，如含有丙烯酸或其它杂质，则造成凝胶聚合时间延长，聚合不均匀或不聚合，应将它们分别纯化后方能使用。Acr及Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，实验表明对小鼠得半致死量为170mg/kg，操作应在通风中进行。Acr的纯化：称70gArc溶于1000ml 50℃预热的氯仿中，溶解后趁热过滤。冷却后，置-20℃低温冰箱中，则有白色结晶析出，用预冷的布氏漏斗抽滤，收集白色结晶，再用预冷的氯仿淋洗几次，真空干燥后置棕色瓶中密封储存。Acr的熔点为84.5+0.3。纯Acr水溶液pH应是，其pH值变化不大于0.4pH单位就能使用。Bis的纯化：称12gBis，使其溶于1000ml预热40-50℃ 的丙酮中，趁热过滤。冷却后，置-20℃ 低温冰箱中，待结晶析出后，用预冷的布氏漏斗抽滤，收集结晶，用预冷丙酮洗涤数次，真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存，Bis熔点为185℃。Acr和Bis的储液在保存过程中，由于水解作用而形成丙烯酸和NH3，虽然溶液放在棕色试剂瓶中，4℃储存能部分防止水解，但也只能储存1-2个月，可测pH值（4.9-5.2）来检查试剂是否失效。

2．由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥交时凝胶板易断裂，为防止次现象，所以器材应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡抹海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板侵泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

3．安装电泳槽和镶有长、短玻璃的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋转紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。

4．用琼脂（糖）封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。

5．凝胶完全聚合后，必须放置30min-1h，使其充分“老化”后，才能轻轻取出样品槽模板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳区带扭曲。

6．为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品槽可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100ug蛋白/100ul。

7．在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，洗净胶面后才能制备脓缩胶。浓缩胶制备后， 不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

8．电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压、过高或过低均可影响电泳效果。

9．电泳后，应分别收集上下储槽电极缓冲液，在冰箱储存，可用2-3次。为保证电泳结果满意，最好用新稀释的缓冲液。