聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白(serum proteins)-1
目的与原理]
掌握一种聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的方法，并用此法进一步分析血清蛋白的组成。
1、聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）、NN′—甲叉双丙烯酰胺（Bis），在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate (NH4)2S2O8 简称AP）或核黄素（ribofavin 即vitamin B2 ,C17H20O6N4）和加速剂N,N, N′,N′—四甲基乙二胺（N,N,, N′N′—ytetramethyl ethyenediamine，简称TEMEM）的作用下，聚合而成的三维网状结构。
a.目前常用的催化体系：
(1) Ap—TEMED：
① TEMED催化Ap生成硫酸自由基：
S2O82— →2SO4—
（过硫酸） （硫酸自由基）
②硫酸自由基的氧原子激活Acr单体，并形成单体长链：
③Bis 将单体长链间连成网状结构：
从反应式中可看出此凝胶是三维网状的，带不活泼的酰胺基侧链的聚合物，没有或很少带有离子侧链，因而凝胶性能稳定，无电渗作用。在碱性条件下，凝胶易聚合，其聚合的速度与Ap浓度平方根成正比。杂质、某些金属离子，低温和氧分子能延长或阻止碳链的延长与聚合作用。用此法聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶。
(1) 核黄素—TEMED： 这是光聚合作用。TEMED可加速凝胶的聚合，但不加也可聚合，光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能发生，核黄素在 TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量氧会阻止链长的增加，因此应避免过量氧的存在。
b. 凝胶的性质
(1) 机械性能与孔径
T＝（a+b）/m×100% T:凝胶总浓度，a：Acr克数，b：Bis克数，m，缓冲液体积（ml）
C=b/(a+b)×100% C：交联度
a/b(w/w)与凝胶的机械性密切相关。当a/b<10时凝胶脆而易碎，坚硬呈乳白色；a/b>100时，即使5％的凝胶也呈糊状，易断裂。预制备完全透明而又有弹性的凝胶应控制a/b＝30左右。不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，B.J.Davis的实验发现Acr<2％，Bis<0.5%,凝胶就不能聚合，当增加Acr浓度时要适当降低 Bis的浓度，通常T为2%—5％时，a/b＝20左右；T为5%—10％时，a/b＝40左右。T为15%—20％时，a/b＝125—200左右。在研究核酸大分子时，常用T=2.4%大孔凝胶，此时凝胶太软不易操作，最好加入0.5％琼脂糖，有的在3％凝胶中加入20％蔗糖，也可增加其机械强度而不影响其孔径的大小。一般来说，T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大；T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。
（2）分子量范围与凝胶浓度关系如下表1-2-9
2、电泳原理
（1）浓缩效应
①凝胶孔径不连续；样品胶T＝2.5％为大孔胶，分离胶T＝7.5％为小孔胶。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢，所以在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
表1-2-9 分子量范围与凝胶浓度的关系
② 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性（电位梯度不连续性）样品胶和浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl,缓冲液，电极缓冲液为pH8.3的Tris- Gly。HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl—,而Gly的pI为5.97，所以Gly在样品胶和浓缩胶中解离度很小，仅有1%－0.1%。而有效迁移率＝mα（m为迁移率，α为解离度），所以Cl-的有效迁移率最快成为快离子，而Gly的有效迁移率最慢成为慢离子，在样品胶和浓缩胶中所选用的pH值必须使有效迁移率满足下述条件：
快离子>样品离子>慢离子。因此在快离子后边形成一个离子浓度低的区域，即：低电导区，又因为E＝I/η（E：电位梯度，η：电导率，I：电流）。低电导率将产生一个高电位梯度，因而在高电压梯度区和低电压梯度区之间，形成一个迅速移动的界面（如图1-2-11）。由于样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，所以就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄膜。
图1-2-11不连续电泳浓缩效应示意图
（2） 分子筛效应：进入分离胶后，分离胶为pH为8.9的Tris—HCl 缓冲液Gly解离度增大，因而它的有效迁移率也增加，此时Gly很快就赶上并超过样品分子，这样高电压梯度就不存在了，使样品进入一个均一的电位梯度和pH条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，分子量或形状不同的样品通过分离胶，所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率。
(3)电荷效应：进入分离胶后，样品除了具有分子筛效应外还根据带电荷不同，迁移率不同进行分离
[试剂与器材]
试剂：
1、按下表配制贮液和工作液
贮液 | 100 ml 溶液中的含量 | pH | 工作溶液混合比 |
1 | 1mol/L HCI 48.0ml | 8.9 | 小孔径胶〈分离胶 ) |
2 | Acr28.0g | ||
3 | Ap0.14g | ||
4 | 1mol/L HCI48.0ml | 6.7 | 大孔径胶〈浓缩胶 〉 |
5 | Acr10.0g | ||
6 | 核黄素4.0mg | ||
7 | 蔗糖40.0g | ||
电极缓冲液 | 8.3 | 用时稀释 10 倍 |
2、0.1％溴酚蓝指示剂
3、染色液 用7％醋酸液配制成1％氨基黑10B染色液。
4、脱色液 7％醋酸溶液
材料：
人、鱼等动物血清。
器材：
常压电泳仪；圆盘电泳槽；玻璃管（内径约0.5 cm—17.5px，长度约8 cm— 250px）；有机玻璃架（或自制木头架）；微量进样（100μL）器；5ml注射器；长、短注射针头；长、短颈滴管；日光灯或100w白炽灯；乳胶管；玻璃球（或小段玻璃棒）；培养皿；烧杯；洗耳球。
