新药研发动力：21世纪质谱技术驱动药物代谢研究前进
作者：黄莹莹博士，市场战略专家，赛默飞世尔科技，圣何塞，加利福尼亚，美国
在药物研发的历史上，信息是无与伦比的动力。对一个药物研发公司来说，尽可能早的掌握药物研发过程中候选药物代谢过程的具体信息是至关重要的。它可以节省时间、宝贵的资源，以及最大化投资收益率。成功的候选药物的最后选择，很大程度上依赖于体内和体外的药物代谢研究。
质谱是药物代谢研究中用到的一个关键性的分析工具，因为它可以识别代谢物，确定代谢发生的位点。液相色谱与质谱联用(LC-MS/MS)法因为灵敏度高和分析复杂混合物的能力，已经成为代谢鉴定的特别技术。但是，在分析灵敏度与过去数十年相比极大改进的同时，非常复杂的生物基质存在的情形下检测和鉴定代谢物仍然是一种挑战。
质谱的硬件和软件上的新发展正在帮助解决正在进行的这种挑战。例如，将Orbitrap™ 质量分析器串联到线性离子阱质谱上，就可以简化代谢鉴定过程，使之更快，更灵敏，更精确(分辨率超过100K，质量精度大于3ppm)，并且可以揭示丰富的结构信息。有了高分辨和精确的质量数据后，研究人员可以从背景的基质离子中解决和识别代谢物的峰。新的数据处理技术，比如质量亏损过滤，可以用于去除基质相关的大量的背景离子，缩小假阳性的数目，提供更可信的结果。
本指南描述了创新性的质谱和质量亏损过渡软件的结合，如何导致代谢物鉴定更快更精确。
质量亏损过滤帮助分离潜在的候选药物
高分辨质谱能够应用数据采集后的数据精炼技术，这个技术在标称分辨率的仪器上是不可能实现的。其中之一就是质量亏损过滤(MDF)，在净化代谢物谱图和过滤大量的背景离子从而改善信噪比方面取得了显著的成效。
“质量亏损”指的是一个元素（或者一个化合物）的精确质量数和它最接近的整数值（见表1）之间的差异。代谢物的质量亏损通常位于相当窄的范围内。基于母体药物的分子量，研究人员可以估计这些代谢物的分子量范围和质量亏损落在什么区间。质量亏损过滤用于排除落在期望的范围之外的所有离子。
这个数据缩减技术允许用户单单注意潜在的候选药物代谢物分析，它是用高分辨质量数据获得小的更精炼的数据集的最强大最精细的方式之一。这种方法也可以扩展 于多重质量亏损过滤(MMDFs)，也就是在一个相对较宽的质量亏损范围内用几个过滤器来鉴定感兴趣的代谢物。
用质谱鉴定代谢物
代谢物鉴定通过将多重质量亏损过滤应用于LTQ Orbitrap XL™组合质谱仪（赛默飞世尔科技）的数据收集过程来执行。该质谱仪的特点是执行高能碰撞解离(HCD)进行裂解反应的碰撞室(图1)。高能碰撞解离能够提供线性离子阱中碰撞诱导解离之外的辅助裂解算途径。离子离开C-trap（见图1）后被加速，然后在充满氮气的HCD碰撞室裂解。因此而产生的碎片返回到C-trap，然后在仪器的质量分析器中被检测。这个技术产生丰富的“类似三重四极杆”裂解方式，包括对说明代谢物结构非常有用的低m/z质量范围的碎片。
图1：LTQ Orbitrap XL示意图，突出C-trap后面的HCD碰撞室。
伊立替康是一种被认可使用的治疗结肠和直肠癌的药物。用老鼠的肝脏细胞孵育伊立替康样品，再用带高能碰撞解离功能的LTQ Orbitrap XL仪器分析。收集潜在代谢物的碰撞诱导解离(CID)和高能碰撞诱导质谱图，并且用多重质量亏损过滤处理原始数据。
材料和方法
样品：用一个雄性老鼠和一个雌性老鼠混合的肝细胞进行孵育实验，细胞密度为50万个/mL，伊立替康在最终1mL的孵育液中的浓度为10 µM。溶液震摇过夜，用干冰淬灭，然后加入200µL冷冻的乙腈，将溶液涡旋混合，离心。从1mL上清液中取出10 µL，进LC-MS/MS系统进行分析。
高效液相色谱： Thermo Scientific Accela高速液相；
色谱柱： Thermo Scientific Hypersil GOLD，1×100 mm, 1.9 µm粒径；
质谱：Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL，带HCD碰撞室。
结果
图2：伊立替康的MS/MS质谱图：(a) 线性离子阱采集的碰撞诱导解离MS/MS质谱图；(b) Orbitrap采集的高能碰撞解离MS/MS质谱图。
表1.从老鼠肝细胞孵化的10μM伊立替康样品中鉴别出来的假定代谢物。用不同颜色加亮的部份已经用不同的质量亏损过滤器过滤了。
使用高能碰撞解离和碰撞诱导解离(表2)的同时，结合使用多重质量亏损过滤，可以从孵育样品中鉴别15种伊立替康代谢物，精确度优于3ppm (表1)。所有的15种代谢物的峰面积均小于母体化合物的1%，并且隐藏在原始的色谱图中(图3a)。 应用单次质量亏损过滤后，丰度最高的代谢物的峰变成可见了(图3b)。然而，目前跟代谢物无关的背景基质离子产生的峰仍然很突出。这是为了仅仅使用一次质量亏损过滤来俘获所有的代谢物，使用了相对较宽的质量亏损范围。因此，一部份背景离子在单次质量亏损过滤后仍然会残留下来。
接下来，四个不同的质量亏损过滤器用Thermo Scientific MetWorks软件包应用原始数据中。这个软件包可同时应用六个质量亏损过滤器。处理后的色谱图更干净(图3c)。
图3：老鼠肝细胞孵育10mM伊立替康的基峰色谱图：(a)原始的；(b)单次质量亏损过滤；(c)多重质量亏损过滤(MMDF)。
图4：8.45分钟位置的全扫描质谱图：(a)原始的；(b)单次质量亏损过滤；(c)多重质量亏损过滤(MMDF)。
图4进一步阐明了质量亏损过滤后全扫描质谱图如何变化的。m/z 603.2805的峰是在8.45分钟流出的一个羟基化代谢产物(M3)。在原始的全扫描质谱图中，背景离子占绝对优势，M3仅仅只有小于15%的相对丰度(图4a)。经过单次质量亏损过滤后，M3峰变成了基峰。然而，仍然有许多背景峰残存在谱图中(图4b)。经过多重质量亏损过滤后，谱图中仅有M3峰和痕量的母峰存在，与此同时，几乎所有的背景离子消失了(图4c)。
高能碰撞解离和碰撞诱导解离的结合使用，提供了全面的裂解信息。多重质量亏损过滤提供了比单次质量亏损过滤更高的背景鉴别能力，能够鉴别出峰面积小于母体药物峰面积1%的代谢物峰。
展望
最近几年，质谱经历了长足的发展，正在缔造药物研发公司执行代谢物鉴定研究的美好前景。制药公司期望仪器能够实现尽可能少的用户干涉，提供高能量的分析和高质量的数据。随着进程的瓶颈转移到数据处理方面，数据缩减技术必须继续改进以适应这种挑战。
关于赛默飞世尔科技
Thermo Fisher Scientific(赛默飞世尔科技)（纽约证交所代码：TMO）是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过100亿美元，拥有员工约33,000人，在全球范围内服务超过350,000家客户。主要客户类型包括：医药和生物公司，医院和临床诊断实验室，大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于Thermo Scientific和Fisher Scientific这两个主要的品牌，帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。Thermo Scientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。Fisher Scientific为卫生保健，科学研究，以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，提升客户价值，帮助股东提高收益，为员工创造良好的发展空间。欲获取更多信息，请浏览公司的网站：www.thermo.com.cn
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